[發(fā)明專利]一種惡臭假單胞菌烯醇酶基因克隆方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110275886.0
• 申請(qǐng)日: 2021-03-15
• 公開（公告）號(hào): CN112941090A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡風(fēng)慶;趙小慧;吳停停
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遼寧大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/60
• 分類號(hào): C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽杰克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

1.一種惡臭假單胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)提取惡臭假單胞菌總DNA；

2)以提取的總DNA為模板，以上游引物P1和下游引物P2為特異性引物，通過PCR擴(kuò)增獲得目的片段；P1和P2的序列為：

P1：GATAAGCTTGTATGGCAAAAATCGTCG

P2：CATCTCGAGTTAGCCGCGAAACTC

3)將目的片段與表達(dá)載體pET28a經(jīng)HindIII/XhoI雙酶切，T4連接酶16℃過夜連接，

獲得重組質(zhì)粒pET28a-eno；

4)將重組質(zhì)粒pET28a-eno轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌；

5)將重組菌通過Kan抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子；

6)挑取單菌落接種于含有Kan的培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜；按1-3％接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5，加入終濃度為0.2-1mM的IPTG，于20-30℃培養(yǎng)4h；8000rpm離心，收集菌體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種惡臭假單胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，步驟2)中，PCR擴(kuò)增體系是：ddH₂O 32.5μl，10×PCR Buffer 5μl，Mg²⁺ 5μl，dNTP Mixture 4μl，模板DNA 1μl，上游引物P1(25μM)1μl，下游引物P2(25μM)1μl，pfu DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種惡臭假單胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，步驟2)中，PCR擴(kuò)增條件是：95℃預(yù)變性8min；95℃變性45s，63℃退火30s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min；4℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種惡臭假單胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，步驟4)中，加入IPTG至終濃度為1mM。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種惡臭假單胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，步驟4)中，于30℃培養(yǎng)4h。

6.按照權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法獲得的菌體在生物柴油副產(chǎn)物甘油合成PHA中的應(yīng)用。