[發明專利]一種細菌漆酶突變體LacAt及其表達菌株的構建和應用有效
| 申請號： | 202110275524.1 | 申請日： | 2021-03-15 |
| 公開（公告）號： | CN112877304B | 公開（公告）日： | 2022-07-26 |
| 發明（設計）人： | 王晶晶;張雁;王玲玲;程誠;王恒生;周夏珍;錢勇 | 申請（專利權）人： | 合肥師范學院 |
| 主分類號： | C12N9/02 | 分類號： | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C02F3/34;C12R1/19;C02F103/30 |
| 代理公司： | 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101 | 代理人： | 喬恒婷 |
| 地址： | 230601 安徽*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 細菌 突變體 lacat 及其 表達 菌株 構建 應用 | ||
1.一種細菌漆酶突變體LacAt，其特征在于：
所述細菌漆酶突變體LacAt的蛋白序列如SEQ ID No：1所示。
2.根據權利要求1所述的細菌漆酶突變體LacAt，其特征在于：
所述細菌漆酶突變體LacAt的基因序列如SEQ ID No：2所示。
3.權利要求1或2所述的細菌漆酶突變體LacAt的表達菌株的構建方法，其特征在于包括如下步驟：
步驟1：突變體LacAt編碼基因的獲得
以Anoxybacillussp漆酶LacAn的cDNA為模板，以如下引物在氨基酸序列中引入G79D、A138V兩處突變位點：
79F：GACCAAGTGCAT
79R：TATATGCAC
138F：AAGCTAATTGGG
138R：CGTGTGC
LacAtF：CC
LacAtR：C
以常規PCR方式擴增并獲得突變體LacAt編碼基因，并在全長序列擴增時引入NdeI和XhoI兩處酶切位點，回收LacAt目的片段；
步驟2：重組質粒的構建
以NdeI和XhoI兩種限制內切酶分別將回收后的LacAt目的片段和pET22b載體于37℃水浴中雙酶切3-5h，將兩組酶切產物回收后，各取100ng回收產物，在T4連接酶作用下于16℃環境中將LacAt編碼基因正向插入pET22b的NdeI和XhoI酶切位點之間，獲得重組質粒；
步驟3：突變體LacAt重組表達菌株的構建
將重組質粒轉入E.coli BL21(DE3)感受態細胞中，轉化產物涂板于LB平板在28-37℃培養，隨機挑取部分單克隆，以菌落PCR方式驗證陽性克隆；將陽性克隆接種于含有5mL液體LB試管中，于28-37℃、120-200rpm培養，取菌液保存于10-30％的甘油管中，放置于-80℃中以保菌。
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