[發明專利]用于擴增水牛IL-2基因編碼區引物及IL_2蛋白的原核表達方法

在審

• 申請號: 202110274730.0
• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN112921042A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 謝芝勛;李小鳳;范晴;謝志勤;謝麗基;李孟;羅思思;鄧顯文;黃嬌玲;張艷芳;曾婷婷;王盛;張民秀;李丹;萬麗軍;韋悠;阮志華;任紅玉
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/26
• 分類號: C12N15/26;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C07K14/55;C07K1/22;C07K1/34;C07K1/36;A61K38/20;A61P31/14;A61P1/12;C12R1/19
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 藍文苑

本發明提供的用于擴增水牛IL?2基因編碼區的引物，包含具有上游引物SEQ ID NO:1和下游引物SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。提供了該引物在PCR擴增中的應用；通過加入表達載體pET?32a構建了重組表達質粒Pet?32a?IL?2，并用IPTG誘導目的蛋白表達及其純化方法，表達的IL?2蛋白能與His標記抗體和山羊IL?2多克隆體反應，本發明為研發重組水牛IL?2蛋白疫苗及研制治療性生物劑奠定基礎，對水牛養殖業的健康發展有重要的現實意義。

技術領域

本發明屬于獸藥生物技術領域，具體涉及用于擴增水牛IL-2基因編碼區引物及IL_2蛋白的原核表達方法。

背景技術

水牛白細胞介素-2蛋白(IL-2，以下簡稱“IL-2”)，又名T細胞生長因子(Tcellgrowthfactor,TCRF)，由155個氨基酸組成，分子量大小為17.5KDa。IL-2蛋白主要由T淋巴細胞在受到抗原物質或者是絲裂原刺激后合成并分泌；此外，B淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)及單核-巨噬細胞也能夠產生IL-2。

研究表明，水牛IL-2蛋白能促進T淋巴細胞的CD4+，CD8+增值，增強自然殺傷細胞(NK細胞)，單核細胞等的殺傷活性。水牛IL-2蛋白作為免疫佐劑，與疫苗共同使用時能提高疫苗的免疫作用，如在牛支氣管炎病毒和牛皰疹病毒疫苗免疫中起到很好的作用，能有效的預防和治療奶牛乳房炎，在小鼠、牛體內使用重組IL-2蛋白能增強對皰疹病毒的抵抗力，提高了抗病毒的作用。

而目前，國內對牛的IL-2研究報道較多[13-19]，而水牛IL-2蛋白的研究停留在基因的克隆序列分析上[20-21]。水牛是南方重要的家畜，具有耐熱，耐粗飼等特點，因為奶水牛的牛奶營養豐富，水牛的經濟價值進一步提高，飼養規模增大，流行性疾病仍在盛行，其中牛病毒性腹瀉病毒呈世界分布，感染后牛出現發熱、腹瀉、流產、死胎及畸形胎等癥狀，是影響牛產業發展的重要因素，新的疫苗藥物研發是做好疾病防控的重要手段。

發明內容

本發明的目的在于提供一種水牛IL-2蛋白及其原核表達方法，具體方案如下：

用于擴增水牛IL-2基因編碼區的引物，包含上游引物和下游引物，它們分別具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

進一步地，所述上游引物中具有BamH I酶切位點，下游引物中具有HindⅢ酶切位點。

如所述的用于擴增水牛IL-2基因編碼區的引物在PCR擴增中的應用。

進一步地，所述PCR擴增的反應程序為95℃預變性3min；95℃變性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，34個循環；最后一次72℃延伸5min，獲得擴增產物，所述擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，與pMD18-T載體連接，構成克隆載體，轉化DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，雙酶切鑒定。

一種水牛IL-2蛋白的重組表達質粒Pet-32a-IL-2。

進一步地，包括表達載體pET-32a，所述表達載體pET-32a和T-IL-2質粒通過HindⅢ和BamHI限制性內切酶于37℃雙酶切6h，切膠回收酶切產物，將表達載體pET-32a和水牛IL-2蛋白編碼區基因片段于16℃連接過夜。

一種含有所述重組表達質粒Pet-32a-IL-2的重組基因工程菌，所述重組基因工程菌的宿主細胞為大腸桿菌。

一種所述的水牛IL-2蛋白原核表達方法，包括如下步驟：