[發明專利]實現XX/XY性別遺傳決定型魚類性別控制育種的方法及應用

有效

• 申請號: 202110274642.0
• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN113789352B
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 殷戰;翟剛;舒婷婷;賀江燕;婁氣永;姜冬火;錢雪橋;石闖;黃建飛;賈景怡;金霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/113;A01K67/027;A01K61/10
• 代理公司: 武漢卓越志誠知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42266
• 代理人: 胡婷婷

本發明提供了一種實現XX/XY性別遺傳決定型魚類性別控制育種的方法及應用。該方法通過利用CRISPR/Cas9系統特異性切割魚類的cyp17a1，阻斷魚類的性類固醇激素合成通路，獲得有效突變的F1代cyp17a1雜合子魚(cyp17a1+/?)，并進行自交，通過性別標記篩選出XX性別遺傳型的F2代cyp17a1純合子(cyp17a1?/?XX)的偽雄魚，并將其與野生型雌魚(cyp17a1+/+XX)進行雜交，可獲得100％雌性魚群體(cyp17a1+/?XX)，從而獲得全雌養殖魚的群體養殖，實現性別控制育種的效果。通過生長對比實驗顯示，本發明提供的全雌群體8月齡體重比野生型對照群體增加6.60％，有效實現魚類產量的提高，進而提升養殖效率。本發明提供的方法具有很強的應用性，在XX/XY性別遺傳決定型的水產養殖經濟魚類中有廣泛的適應性和擴展性。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，還涉及魚類育種領域，尤其涉及一種實現魚類性別控制育種的方法及應用。

背景技術

性別控制育種是指人為干預目標物種的性別發育過程，使其后代為符合期望性狀的技術。動物的性別控制育種在遺傳疾病的機制解析和預防治療、提高產量和品質、提高抗逆能力等方面具有重要意義。近些年，水產業的食物產生量是眾多行業中最快速的。在眾多水產物種中，有很多是生長上表現出明顯的兩性異形，即某一個性別的生長速度顯著快于另一個性別，例如鯉的雌性生長顯著快于雄性。因此，單性群體的養殖將會帶來明顯的經濟效益。

魚類的性別決定較哺乳動物具有較高的可重塑性，眾多外源激素的處理可誘導性別偏離其自身遺傳性別決定系統，例如甲基睪酮在誘導XX雌魚發育為偽雄魚的過程中被廣泛應用。因此，激素誘導性逆轉在大規模生產單性群體中是最為常見的辦法。例如：申請號為CN201410560624.9的發明專利公開的一種誘導雌核發育黃姑魚偽雄魚的方法。但應用該方法的過程中也由此產生了眾多的不良效應，例如激素對水體的污染、激素在魚體的殘留、耗時長、激素關聯物誘導的親魚性別發育不穩定、無法大規模連續生產等。因此，開發基因編輯的手段進行偽雄性及單性群體的創制等性別控制育種和單性群體養殖方法的研發尤為緊迫。

申請號為CN201910878588.3的發明專利公開了一種在黃顙魚中雙 gRNA位點敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系統及應用。所述CRISPR/Cas9 系統包括以下步驟：(1)靶位點1設計在黃顙魚dmrt1基因第一外顯子上，靶位點2設計在第三外顯子上；(2)根據步驟(1)的靶位點序列設計引物檢測親魚中靶位點的準確性，用dmrt1E1F和dmrt1E1R擴增靶位點1及附近序列，用dmrt1E3F和dmrt1E3R擴增靶位點2及附近序列；(3)以 pUC19-gRNA-scaffold質粒為模板，用dmrt1E1gRNA F和gRNA R進行 gRNA1片段的PCR擴增，用dmrt1E3gRNA F和gRNA R進行gRNA2片段的PCR擴增；以上述PCR產物為模板，體外轉錄并純化獲得gRNA；(4)以pXT7-hCas9線性化質粒為模板，體外轉錄合成Cas9 mRNA；(5)將Cas9 mRNA 和兩個gRNA顯微注射到黃顙魚一細胞期胚胎中；(6)檢測突變類型，計算基因編輯率。但是，該方法僅關注了基因編輯的操作和基因編輯率，未進行后代生殖發育方面的表型觀察、偽性別的確定、與野生型個體的雜交、以及最終單性群體的構建，即，上述方法未將基因編輯方式與魚類性別控制以及育種方式之間進行有效結合，所以未能實現魚類性別控制育種和單性群體養殖。

有鑒于此，有必要設計一種實現魚類性別控制育種的方法及應用，以解決上述問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種實現XX/XY性別遺傳決定型魚類性別控制育種的方法及應用。

為實現上述發明目的，本發明提供了一種實現XX/XY性別遺傳決定型魚類性別控制育種的方法，采用基因編輯技術敲除魚類中的性類固醇激素合成通路的催化酶編碼基因，阻斷魚類的性類固醇激素合成通路，顯著降低魚類雌激素和雄激素的水平，由此制備得到XX性別遺傳型的偽雄魚，再將所述偽雄魚與野生型雌魚進行雜交，由此得到全雌群體，實現魚類性別控制育種和單性群體養殖。