[發(fā)明專利]一種體外培養(yǎng)小鼠次級(jí)卵泡的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110274259.5
• 申請(qǐng)日: 2021-03-15
• 公開（公告）號(hào): CN112980773A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭映純;方叢;梁曉燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發(fā)明涉及卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種體外培養(yǎng)小鼠次級(jí)卵泡的方法。本發(fā)明采用純機(jī)械法分離次級(jí)卵泡，減少酶解對(duì)卵泡結(jié)構(gòu)完整、卵子發(fā)育潛能的影響；采用V型底96孔板培養(yǎng)代替凝膠系統(tǒng)的立體支撐功能，明顯縮減系統(tǒng)流程，減少低溫、酶解損傷，避免凝膠性質(zhì)改變導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)支持不足、卵泡體積擴(kuò)大受限問題。在常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4，彌補(bǔ)體外培養(yǎng)系統(tǒng)較體內(nèi)發(fā)育卵泡的不足，改善卵泡發(fā)育潛能及卵子質(zhì)量，提高次級(jí)卵泡體外培養(yǎng)系統(tǒng)效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種體外培養(yǎng)小鼠次級(jí)卵泡的方法。

背景技術(shù)

小鼠次級(jí)卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)是從小鼠卵巢中分離出次級(jí)卵泡，并在體外培養(yǎng)至成熟的過程，是研究小鼠卵泡發(fā)育過程發(fā)生的生理或病理事件的重要工具，近年來也應(yīng)用于腫瘤患者生育力保存(卵泡體外培養(yǎng))系統(tǒng)構(gòu)建的前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｔu(píng)估該系統(tǒng)效率的指標(biāo)主要是卵泡的存活率和卵子的體外成熟率。目前文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠次級(jí)卵泡體外培養(yǎng)步驟如下：(1)酶解法處理小鼠卵巢，在解剖培養(yǎng)基中分離出次級(jí)卵泡；(2)將次級(jí)卵泡清洗2次后轉(zhuǎn)移至維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)30分鐘至1小時(shí)；(3)將次級(jí)卵泡清洗2次后移至凝膠液滴，滴入氯化鈣液體中進(jìn)行耦聯(lián)；(4)將包裹在凝膠的次級(jí)卵泡轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)培養(yǎng)基清洗2次，再轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板(裝生長(zhǎng)培養(yǎng)基)中培養(yǎng)10天，每2天更換一次生長(zhǎng)培養(yǎng)基；(5)在培養(yǎng)第10天時(shí)，將包裹在凝膠中的卵泡轉(zhuǎn)移至凝膠消化酶中消化，分離出卵泡，清洗2次后再轉(zhuǎn)移至成熟培養(yǎng)基中行體外成熟，16小時(shí)后在透明質(zhì)酸酶中消化2分鐘，脫去顆粒細(xì)胞后觀察卵子排出第一極體的情況。

上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)：(1)整個(gè)過程需要3次酶解過程，對(duì)卵泡的完整性及卵子的質(zhì)量存在負(fù)面影響；(2)凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)過程繁復(fù)，明顯增加卵泡在合適的培養(yǎng)環(huán)境(37℃二氧化碳培養(yǎng)箱)外的時(shí)間，低溫對(duì)卵泡的發(fā)育可造成影響；(3)反復(fù)轉(zhuǎn)移卵泡近20次，易對(duì)卵泡的結(jié)構(gòu)造成損害，且易在轉(zhuǎn)移過程中丟失卵泡，降低培養(yǎng)系統(tǒng)效率；(4)隨著體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，凝膠的通透性改變，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滲透率下降，影響卵泡的發(fā)育；凝膠的硬度也發(fā)生改變，限制生長(zhǎng)后期卵泡直徑的擴(kuò)大和竇腔的形成；(5)現(xiàn)有的常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基只添加FSH、LH來模擬垂體分泌激素促進(jìn)卵巢中卵泡生長(zhǎng)的生理情況，彌補(bǔ)體外卵泡發(fā)育環(huán)境的不足，但實(shí)際上垂體對(duì)卵巢生理功能的支持作用遠(yuǎn)不止這兩種激素，體外培養(yǎng)體系的模擬效率仍不足。已有的文獻(xiàn)報(bào)道，卵泡存活率波動(dòng)在68～84％，成熟率波動(dòng)在26～50％，遠(yuǎn)低于體內(nèi)發(fā)育卵泡的存活率和成熟率，且不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種體外培養(yǎng)小鼠次級(jí)卵泡的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：提供一種體外培養(yǎng)小鼠卵泡的方法，所述方法為采用純機(jī)械法分離小鼠卵泡。

本發(fā)明采用純機(jī)械法代替酶解法分離次級(jí)卵泡，可減少酶解對(duì)卵泡結(jié)構(gòu)完整、卵子發(fā)育潛能的影響。

作為本發(fā)明所述方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述卵泡為次級(jí)卵泡。

作為本發(fā)明所述方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述純機(jī)械法分離小鼠次級(jí)卵泡具體包括以下步驟：

(1)剪下小鼠卵巢及周圍少許組織，置于解剖培養(yǎng)基中；

(2)次級(jí)卵泡分離：在解剖顯微鏡下，用胰島素注射器針頭將卵巢組織分離出來，置于預(yù)熱的解剖培養(yǎng)基中，在解剖培養(yǎng)基中用胰島素針頭剝離次級(jí)卵泡，挑選基底膜完整、卵子形態(tài)正常、直徑大約100-130μm的卵泡；

(3)將次級(jí)卵泡置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

作為本發(fā)明所述方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4。

本發(fā)明通過在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加有利因素進(jìn)一步模擬垂體對(duì)卵巢的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，提高卵泡體外培養(yǎng)系統(tǒng)效率。