[發明專利]規模化獲得XX/XY性別決定的偽雄魚親本的育種方法及其應用

有效

• 申請號: 202110274222.2
• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN113817779B
• 公開（公告）日: 2023-05-19
• 發明（設計）人: 殷戰;翟剛;舒婷婷;婁氣永;賀江燕;姜冬火;錢雪橋;石闖;黃建飛;賈景怡
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/55;C12N15/53;A01K67/027
• 代理公司: 武漢卓越志誠知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42266
• 代理人: 胡婷婷

1.一種規模化獲得XX/XY性別決定的偽雄魚親本的育種方法，其特征在于：所述規模化獲得XX/XY性別決定的偽雄魚親本的育種方法采用基因編輯技術敲除魚類的性類固醇激素合成通路的催化酶編碼基因，用以阻斷魚類的性類固醇激素合成通路，并篩選獲得有效突變的雜合子雌魚和XX性別遺傳型的偽雄魚，再將所述偽雄魚與所述雜合子雌魚進行雜交，由此得到高偽雄群體，規模化擴大偽雄魚親本種群的數量；

所述性類固醇激素合成通路的催化酶編碼基因為cyp17a1催化酶編碼基因；

包括如下步驟：

S1，利用基因編輯技術敲除魚類中的cyp17a1基因，獲得F0代；

S2，將F0代雄魚與野生型雌魚進行雜交，獲得有效突變的F1代cyp17a1雜合子魚，其基因型為cyp17a1+/-；

S3，將所述F1代cyp17a1雜合子魚進行自交，獲得F2代；

S4，在所述F2代中，篩選無雄性標記的、XX性別遺傳型的cyp17a1純合子魚，其表現為生理雄性，記為偽雄魚，基因型為cyp17a1-/-?XX；

S5，將基因型為cyp17a1+/-?XX的雜合子雌魚和基因型為cyp17a1-/-?XX的所述偽雄魚進行雜交；

S6，經過人工催產和授精后獲得F3代高偽雄群體，其中F3代雄魚全部是基因型為cyp17a1-/-?XX的偽雄魚，由此規模化獲得偽雄魚親本種群。

2.根據權利要求1所述的規模化獲得XX/XY性別決定的偽雄魚親本的育種方法，其特征在于：在步驟S6中，所述F3代雄魚占F3代群體總數的50%，所述F3代雄魚的篩選方法為：在F3代群體中通過腹部擠壓出白色精液的個體，即可判斷為F3代雄魚。

3.根據權利要求1所述的一種規模化獲得XX/XY性別決定的偽雄魚親本的育種方法，其特征在于：所述基因編輯技術為采用CRISPR/Cas9系統特異性切割魚類的cyp17a1基因，實現魚類cyp17a1基因的敲除。

4.根據權利要求3所述的一種規模化獲得XX/XY性別決定的偽雄魚親本的育種方法，其特征在于：在步驟S1中，所述利用基因編輯技術敲除魚類中的cyp17a1基因獲得F0代的具體過程為：

P1，基于CRISPR/Cas9系統，設計魚類cyp17a1基因編輯靶位點；

P2，根據所述魚類cyp17a1基因編輯靶位點設計相應的引物，并合成含有所述魚類cyp17a1基因編輯靶位點的擴增片段的RNA，記為gRNA；

P3，按預定比例配制gRNA、Cas9?mRNA的注射混合物，得到cyp17a1基因編輯的注射混合物，并將所述cyp17a1基因編輯的注射混合物進行魚類受精卵的顯微注射；

P4，將注射后的魚類受精卵養至性成熟，得到F0代。

5.?根據權利要求3所述的規模化獲得XX/XY性別決定的偽雄魚親本的育種方法，其特征在于：所述魚類cyp17a1基因編輯靶位點位于cyp17a1基因1號外顯子上，分為第一靶位點和第二靶位點，所述第一靶位點和所述第二靶位點的基因序列分別如SEQ?ID?NO.1和SEQID?NO.2所示。