[發明專利]一種鑒別靈芝屬真菌的候選DNA條形碼、引物及方法

在審

• 申請號: 202110273122.8
• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN113151539A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 文庭池;楊紅德;康冀川
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 貴陽中工知識產權代理事務所 52106
• 代理人: 王蕊

本發明公開了一種鑒別靈芝屬真菌的候選DNA條形碼、引物及方法，所述引物包括6條序列，一次PCR擴增得到DNA條形碼序列SSU+ITS+LSU片段，引物退火溫度為60℃，擴增目的片段約3000個堿基對，擴增片段應用包括基于Genebank Blast比對的靈芝屬真菌鑒定和靈芝分子系統發育學分析。本發明所述引物具有擴增靈芝屬真菌的特異性、擴增率高、鑒定準確的優點。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種采用分子生物學手段鑒定靈芝屬真菌的方法，具體為一種鑒別靈芝屬真菌的候選DNA條形碼、引物及方法。

背景技術

靈芝是中國名貴中藥材，又稱仙草、瑞草、萬年茸等。靈芝在我國有2000多年的歷史，被歷代醫藥家視為滋補強壯、扶正固本的神奇珍品。靈芝富含靈芝多糖，三萜類，甾醇，氨基酸，蛋白質等600余種成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抗高血壓、抗動脈粥樣硬化、抗衰老、抗輻射等功效，用于治療癌癥，糖尿病，高血壓，失眠、厭食癥、關節炎、哮喘、支氣管炎、胃炎、高膽固醇、紅斑狼瘡等疾病。《中國藥典》將靈芝和紫芝收錄其中，認為靈芝是無毒，安全的藥物。

靈芝屬(Ganoderma P.Karst.)隸屬多孔菌目(Polyporales)靈芝科(Ganodermataceae)，據分類研究報道，全世界有靈芝400余種，中國發現80余種。在古代中國，人們根據顏色將其分為青芝、赤芝、黃芝、白芝、黑芝、云芝六類。民間常做藥用的芝類均以“靈芝”稱呼，實則包括歐洲靈芝、四川靈芝、松杉靈芝、紫芝、薄靈芝、樹舌靈芝、血芝等10余個靈芝種類，其中有四川靈芝和紫芝最為常見。

中國靈芝物種多樣性豐富，不同的靈芝種類含有的藥用成分各異。然而，靈芝種類的鑒定區分非常困難，原因一是靈芝在形態上極為相似，難以根據形態鑒定區分；二是以DNA條形碼等分子手段鑒定必須要以高質量的DNA為前提，市售靈芝在保存過程中極易附帶其它真菌或者被重寄生真菌污染，三是DNA條形碼SSU、ITS、LSU的獲得，如以傳統方法的PCR擴增需要通過多個反應，耗時耗力且不經濟。本發明提出一個可靠、簡便、快速有效的靈芝鑒定方法。

發明內容

本發明的目的是獲得一種鑒定靈芝屬真菌的候選DNA條形碼、引物及方法，利用靈芝屬真菌核糖體的DNA遺傳信息，對靈芝屬真菌進行準確鑒定。

本發明的技術方案：一種鑒別靈芝屬真菌的候選DNA條形碼、引物及方法，所述引物對及其序列為：3214F:CGCCGCTCCATTGGTGATT，3312F:GCAATCAAGCCCCGACTTCC，3294F:ACATGCAATCAAGCCCCGAC，3588F:GCAATCAAGCCCCGACTTCC，3294R:CACTTAAACGCTGACGGCGA，3588R:TCTTCACTGACCTCCACGCC。

所述引物在靈芝屬真菌鑒定中應用。

所述靈芝真菌鑒定需要主要儀器包括PCR儀，主要試劑包括引物、dNTP、MgSO₄、超高保真DNA聚合酶、反應緩沖液，主要軟件工具包括Bioedit、MEGA。

所述靈芝鑒定的步驟包括：

⑴提取靈芝屬真菌的基因組。

⑵以步驟⑴提取的基因組為模板，以混合的正向引物3214F、3312F、3294F、3588F和混合的反向引物3294R、3588R為擴增引物，進行如下的反應體系配制和反應程序：

反應體系

反應程序

⑶取PCR擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

⑷測序獲得序列片段的Blast比對鑒定和系統發育學分析。