[發明專利]一種輪狀病毒滴定方法

在審

• 申請號: 202110272500.0
• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN113293229A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 安祺;張雅春;田大勇
• 申請（專利權）人: 上海青賽生物科技有限公司;北京賽爾富森生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;崔佳佳

1.一種對輪狀病毒滴度進行測定的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(S1)將待測定的輪狀病毒、可被所述輪狀病毒感染的宿主細胞、和培養液置于檢測孔中，形成培養體系，其中，在所述檢測孔中宿主細胞的接種量為1.0×10⁶-1.5×10⁶個/cm²檢測孔的底面積；

(S2)對所述培養體系在適合所述輪狀病毒感染和復制的情況下，培養一段時間t1，從而獲得受輪狀病毒感染的貼壁宿主細胞，其中t1為12-22小時；

(S3)將所述受輪狀病毒感染的貼壁宿主細胞進行固定處理，從而獲得經固定的受輪狀病毒感染的貼壁宿主細胞；

(S4)將所述經固定的受輪狀病毒感染的貼壁宿主細胞與抗輪狀病毒抗體進行接觸，并持續一段時間t2，形成“輪狀病毒-抗輪狀病毒抗體”的復合物，其中，所述的抗輪狀病毒抗體帶有可檢測標記，t2為0.5-2小時；和

(S5)基于所述“輪狀病毒-抗輪狀病毒抗體”的復合物，定量檢測所述檢測孔中的輪狀病毒的數量，從而獲得所述輪狀病毒滴度的測定結果。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(S1)中，包括n個檢測孔，n為≥3的正整數，較佳地n為6-96。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(S1)中，所述的檢測孔包括一組或多組的系列檢測孔，在一組系列檢測孔中，各個檢測孔除了輪狀病毒的數量不同之外，其他條件相同(包括含有相同數量的宿主細胞、和相同成分和體積的培養液、相同的胰酶和胰酶濃度、相同的添加成分等)。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，在所述的一組系列檢測孔中，所述的輪狀病毒的數量是經梯度稀釋的，較佳地梯度稀釋比為2-20。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀釋使用病毒稀釋液，所述病毒稀釋液包括以下組分：DMEM培養基、1-5μg/ml的胰蛋白酶、和100-400μg/ml的氯化鈣。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞選自下組：Vero、MA-104、Caco-2或其組合。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養液為無血清培養液。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(S3)中,固定處理所用的固定劑選自下組：冰丙酮、甲醛、多聚甲醛、無水乙醇或其組合。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗輪狀病毒抗體選自下組：抗VP6抗體、抗VP7抗體、抗VP1抗體、抗VP2抗體、抗VP4抗體或其組合。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述可檢測標記選自下組：FITC、辣根過氧化物酶(HRP)、DyLight 649或其組合。