[發明專利]一種PTCH1基因缺失間充質干細胞的建立方法

在審

• 申請號: 202110272094.8
• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN112852819A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 魏昌盛;林強;王溢文;陳網平
• 申請（專利權）人: 江蘇和澤干細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 北京成實知識產權代理有限公司 11724
• 代理人: 張焱

1.一種PTCH1基因缺失間充質干細胞的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，根據PTCH1基因序列，設計sgRNA序列；

步驟2，sgRNA活性檢測，確定最優sgRNA，最優sgRNA序列為GAGCTGTGGGTGGAAGTTGG，具體步驟包括：

a.將寡核苷酸雙鏈連接到pX330載體上，再將連接產物轉化至E coli DH5α感受態細胞中，擴大培養，提取質粒；

b.將之前構建好的sgRNA與Cas9共表達的22個載體分別轉染至293T細胞中；

c.以b步驟中的細胞裂解后的產物為模板，用設計好的引物進行PCR；

d.酶切步驟c中的PCR產物；

e.通過是否有切開后的相對小的兩條目的條帶以及被切開的條帶所占的比例選擇切割效率最高的sgRNA；

步驟3，將步驟2中切割效率最高的sgRNA和嘌呤霉素抗性的PGK-puro質粒電轉到骨髓間充質干細胞；

步驟4，基因敲除驗證；

步驟5，將基因敲除質粒進行測序。

2.根據權利要求1所述的一種PTCH1基因缺失間充質干細胞的建立方法，其特征在于，步驟2中PCR引物序列為PrimerF:CGATACAAGGCTGTTAGAGA，PrimerR:CCTATTGGCGTTACTATTGAC。

3.根據權利要求1所述的一種PTCH1基因缺失間充質干細胞的建立方法，其特征在于，步驟2中PCR反應體系為2×Phanta Max Buffer 25μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，dNTP Mix 1μL，PrimersF 2μL，PrimersR 2μL。

4.根據權利要求1所述的一種PTCH1基因缺失間充質干細胞的建立方法，其特征在于，使用T7核酸內切酶Ⅰ進行酶切驗證。

5.根據權利要求1所述的一種PTCH1基因缺失間充質干細胞的應用，其特征在于，所述的PTCH1基因缺失間充質干細胞，用于篩選促成骨形成藥物。

6.根據權利要求1所述的一種PTCH1基因缺失間充質干細胞的應用，其特征在于，所述的PTCH1基因缺失間充質干細胞，用于篩選促軟骨形成藥物。