[發(fā)明專利]一種多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110270666.9
• 申請(qǐng)日: 2021-03-12
• 公開（公告）號(hào): CN113046306B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋益哲;梁德燦;唐婷婷;陳曉倩;歐鎮(zhèn)生;李景秋;邢佩雯;劉靖;張世都;郭蕾蕾;鄭清煉;葉群瑞;陳小鋒;李文佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東東陽光藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735;C12N5/074;C12Q1/02
• 代理公司: 北京辰權(quán)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11619
• 代理人: 佟林松

本發(fā)明涉及一種多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，采用48孔板為培養(yǎng)容器，細(xì)胞接種密度為4.5～6.5×10⁵細(xì)胞/mL，培養(yǎng)體積為0.4～0.6mL，采用搖床轉(zhuǎn)速為170～190rpm進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明從無到有建立了一種適于多能干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的48孔板懸浮培養(yǎng)體系，且該培養(yǎng)體系可高效地篩選多能干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法具有成本低、效率高、可維持較好的細(xì)胞形態(tài)、增殖倍數(shù)穩(wěn)定、可維持較好的核型和表型、分化過程中實(shí)驗(yàn)間差異較小等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的特殊細(xì)胞類群。在體外適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，干細(xì)胞可以被大量擴(kuò)增和分化為具有特定功能的細(xì)胞。因此，干細(xì)胞可以為臨床疾病治療提供移植所需的細(xì)胞。同時(shí)，由于藥物篩選和安全性檢驗(yàn)不直接在人體進(jìn)行，人的干細(xì)胞也成為大規(guī)模的新藥篩選和藥物研究的理想模型。

來源于不同發(fā)育階段和不同組織器官的干細(xì)胞在基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳狀態(tài)、體外增殖和分化潛能等方面都存在很大的差異。一般來講，根據(jù)干細(xì)胞增殖能力和分化潛能的不同，可以把干細(xì)胞分為全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)、多能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)、專能干細(xì)胞(multipotent stem cell)和單能干細(xì)胞(unipotent stem cell)。

多能干細(xì)胞失去了發(fā)育為完整個(gè)體的能力，但其可以分化為個(gè)體的所有細(xì)胞類型，進(jìn)而形成身體的所有組織和器官。因此，多能干細(xì)胞在組織分化的研究、藥物試驗(yàn)及再生醫(yī)療等各種領(lǐng)域中被廣泛使用，特別是在誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)建立以后，該領(lǐng)域的研究取得了顯著的發(fā)展。

在多能干細(xì)胞的應(yīng)用過程中，首先需要在維持多能干細(xì)胞的未分化的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)，然后對(duì)多能干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以培養(yǎng)得到目標(biāo)細(xì)胞。

在篩選多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑過程中，目前采用的篩選體系主要有兩種：(1)平面培養(yǎng)分化體系，其缺陷是細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增受到限制，難以獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量用于研究，且分化效率低，無法對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況以及分化情況做一個(gè)精準(zhǔn)評(píng)估。(2)大體系懸浮培養(yǎng)體系，其缺陷是體系大，成本高，無法進(jìn)行大規(guī)模藥篩。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本領(lǐng)域技術(shù)人員希望開發(fā)一種成本低，且能高效篩選多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的體系及方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，在增殖培養(yǎng)過程中，能維持多能干細(xì)胞的良好的干性(stemness)，在分化過程中，分化效率高、實(shí)驗(yàn)間差異小，而且可以高效地篩選多能干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，對(duì)分化情況進(jìn)行精準(zhǔn)評(píng)估。本發(fā)明提供的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)：現(xiàn)有篩選體系中平面培養(yǎng)分化體系的分化效率低、無法對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況以及分化情況做精準(zhǔn)評(píng)估，大體系懸浮培養(yǎng)體系成本高、無法進(jìn)行大規(guī)模藥篩等。

為此，第一方面，本發(fā)明提供一種多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，采用48孔板為培養(yǎng)容器，細(xì)胞接種密度為4.5～6.5×10⁵細(xì)胞/mL，培養(yǎng)體積為0.4～0.6mL，采用搖床轉(zhuǎn)速為170～190rpm進(jìn)行培養(yǎng)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，本發(fā)明所述的48孔板也稱48孔培養(yǎng)板、48孔細(xì)胞培養(yǎng)板等，每孔容積約為1.7mL，可選用市售的常見的48孔板，例如Thermo Scientific Nunclon所售的48孔板(貨號(hào)：150687)，Corning所售的48孔板(貨號(hào)：3548)等。