[發(fā)明專利]一種融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母、制備方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110270368.X
• 申請(qǐng)日: 2021-03-12
• 公開（公告）號(hào): CN113151025A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱佑民;鐘誠(chéng);于婷婷;張慧;鄭業(yè)鴻;雷雨;孟維龍;張文薈;林莉莉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海國(guó)龍生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/62;C12N15/81;C12N9/42;C12N9/40;A23K10/14;A23K20/189;C12R1/84
• 代理公司: 南京禾易知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32320
• 代理人: 張松云

1.一種融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母，其特征在于，包括pPIC9K載體、β-甘露聚糖酶基因以及α-半乳糖苷酶基因，所述β-甘露聚糖酶基因以及α-半乳糖苷酶基因組成融合基因，融合基因兩端包含EcoRI和Not1酶切位點(diǎn)序列和載體pPIC9K的同源臂序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母，其特征在于，所述畢赤酵母的表達(dá)質(zhì)粒包括pPIC9K載體和EcoRI酶切位點(diǎn)以及Not1酶切位點(diǎn)之間的全長(zhǎng)融合基因。

3.一種如權(quán)利要求1-2任一所述的融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、化學(xué)合成改良的β-甘露聚糖酶與α-半乳糖苷酶的融合基因；

S2、酶切S1中所得融合基因與酶切線性化的畢赤酵母表達(dá)載體連接或重組，得融合基因表達(dá)質(zhì)粒；

S3、將S2中構(gòu)建好的融合基因表達(dá)質(zhì)粒酶切線性化后，轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中；

S4、通過(guò)His缺陷和G418抗性篩選出有融合基因插入的畢赤酵母菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，所述S2中融合基因序列與酶切線性化的畢赤酵母表達(dá)載體通過(guò)T4連接酶或2X ClonExpress Mix連接或重組。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，所述S3中表達(dá)質(zhì)粒采用Sacl酶切線性化。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)質(zhì)粒線性化后跑1%的agarose瓊脂糖凝膠確認(rèn)重組質(zhì)粒完全線性化。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，將完全線性化的所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中，220 rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)1.5h。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，將所述整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的融合基因的畢赤酵母菌株跑SDS-PAGE膠鑒定分泌蛋白，挑選得β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的融合基因表達(dá)量高的菌株。

9.一種融合表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：

將畢赤酵母工程菌株轉(zhuǎn)接入含有10-15mL BMGY培養(yǎng)基帶透氣塞的50mL離心管，在28℃，220 rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)至OD600=2-5；

菌體重懸于BMM培養(yǎng)基，220 rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每24h加0.5%甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)4-5天；

c、應(yīng)用：將β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的融合酶作為飼料添加劑應(yīng)用于降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子半乳甘露聚糖。