[發明專利]一株含突變納豆激酶重組基因的工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110269600.8
• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN113005045B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 劉宏生;李佳增;趙鵬燕;朱俊豐
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/57;C12N15/10;C12N9/56;C12R1/84
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

本發明涉及一株含突變納豆激酶重組基因的工程菌及其構建方法和應用。以枯草芽孢桿菌基因為模板，PCR擴增得納豆激酶前導肽?成熟肽基因片段NKt；以NKt基因片段為模板，擴增NKt₁₉₄突變片段；將NKt₁₉₄突變片段按畢赤酵母X33密碼子偏好性進行優化和合成得NKt2；構建PGAPZα?A?NKt2，將PGAPZα?A?NKt2轉化畢赤酵母X33構建真核表達系統的納豆激酶重組基因工程菌株；培養納豆激酶重組基因工程菌株，誘導納豆激酶表達。本發明成功構建一株突變納豆激酶重組基因工程菌LNF012及在真核系統中表達，使原核生物的納豆激酶基因在真核生物體系中成功表達，為今后納豆激酶大規模的應用奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于基因工程領域。具體涉及一株含突變的納豆激酶重組基因的工程菌的構建及在真核系統中表達。

本發明中所稱的一株含突變納豆激酶重組基因的工程菌命名為Komagataellaphaffii?LNF012，已于2020年08月06日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?NO.20498。

背景技術

納豆激酶(Nattokinase，NK)是一種由枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis?varnatto)產生的堿性絲氨酸蛋白酶，經研究發現，納豆激酶具有很好的溶解纖維蛋白(血栓的主要成分)能力。它的溶栓效果高于同類溶栓藥物，且溶栓活性是纖溶酶的4倍。納豆激酶包含三個部分，共381個氨基酸，從N端開始第1至第29個氨基酸構成信號肽，主要作用為介導蛋白質胞外分泌；第30至第106個氨基酸構成前導肽，主要起到幫助蛋白質折疊成正確的空間構象；剩余的275個氨基酸折疊構成具有活性的成熟肽。納豆激酶具有催化三聯體即Asp32、His64、Ser221，底物結合部位在Serl25、Leul26和Glyl27。近年來，研究人員對納豆激酶的溶栓作用機理有了進一步的了解：優球蛋白是一種難以溶解的血漿蛋白質，納豆激酶能夠結合到優球蛋白的表面，發揮催化作用，促進其溶解，間接的促進了纖維蛋白原的降解；內源纖溶酶原激活劑t-PA是一種血管內壁細胞所分泌出的能夠激發纖溶酶活性的生理性激動劑，納豆激酶能夠與血管內壁細胞作用，誘導t-PA的產生，加強纖維蛋白的降解效果；納豆激酶可激活尿激酶原生成尿激酶，激活后的尿激酶可以溶解血栓，和納豆激酶共同作用于血栓溶解；纖溶酶原激活劑的抑制劑(PAI-1)能夠使t-PA失去活性并抑制其產生，納豆激酶能夠直接作用于PAI-1使其降解，保持t-PA的活性，使血栓溶解。目前市面納豆激酶多用于保健類產品。納豆激酶與其他同類的溶栓藥物產品相比，如尿激酶、鏈激酶等產品同樣具有安全性高、生產成本低等的優勢，因而在市場上具有強大的競爭力和市場前景。鑒于納豆激酶功效及發展前景，急需構建一株全新的納豆激酶工程表達菌。

發明內容

本發明的目的是構建一株含突變納豆激酶重組基因的工程菌Komagataellaphaffii?LNF012及在真核系統中表達。

本發明采用的技術方案是：一株含突變納豆激酶重組基因的工程菌，所述含突變納豆激酶重組基因的工程菌命名為Komagataella?phaffii?LNF012，于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?NO.20498。

一株含突變納豆激酶重組基因的工程菌的構建方法，包括如下步驟：

1)獲得納豆激酶前導肽-成熟肽基因片段NKt：以枯草芽孢桿菌DNA為模板，以Primer1和Primer?2為引物，通過PCR方法擴增出NKt基因片段；

NKt基因片段引物序列為：

Primer1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’

Primer2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3