[發明專利]一種金針菇J3673菌種的SSR標記指紋圖譜的鑒定方法及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202110269443.0
• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN112831591A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 陸歡;尚曉冬;王瑞娟;劉建雨;徐珍;張丹;章爐軍;譚琦
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 南京燦爛知識產權代理有限公司 32356
• 代理人: 王江南

1.一種金針菇J3673菌種的SSR標記指紋圖譜的鑒定方法，其特征在于：所述指紋圖譜包括6對SSR標記，具體序列如下：

2.權利要求1所述的金針菇J3673菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，其特征在于：包括，

(1)菌絲培養：將金針菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基上，25℃培養7d后收集菌絲；

(2)基因組DNA的提取：用TAKARA公司的TaqHotStart擴增試劑盒提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；

(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行基因SSR標記的PCR擴增；

(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物與甲酰胺加樣緩沖液混勻，變性，上機檢測；

(5)GeneMapper數據分析。

3.根據權利要求2所述的金針菇J3673菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述步驟(2)基因組DNA的提取，其具體方法包括：

(1)將菌絲樣本加入液氮充分研磨；

(2)向研磨好的粉末中迅速加入360μL BufferSTE和40μL Buffer SDS，迅速渦旋混勻后，將離心管放在65℃水浴15min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣本數次；

(3)加入5μL RNase Solution至裂解液中，渦旋混勻，室溫靜置15-30min；

(4)加入140μL Buffer PS，渦旋震蕩30s，冰上放置10min；

(5)室溫下，13000g離心5min，小心轉移400μL上清液至新的離心管中；

(6)加入600μL Buffer PBD至樣品中，渦旋混勻30s；

(7)把DNA結合柱裝在收集管，轉移一半混合液至柱子中，8000g離心1min；

(8)倒棄濾液把柱子裝回收集管，轉移剩余混合液至柱子中，8000g離心1min；

(9)倒棄濾液把柱子裝回收集管，加入600μLBuffer GW2至柱子中，8000g離心1min；

(10)重復步驟9；

(11)倒棄濾液把柱子裝回收集管，10000g離心2min去除柱子中殘留的乙醇；

(12)將柱子轉移至新的1.5ml離心管中，加入30μL預熱至65℃的Buffer AE至柱子的膜中央，室溫靜置2min，10000g離心1min；

(13)取2μL DNA用于1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，取2μL DNA用于NanoDrop分光光度計測濃度，剩余DNA保存于-20℃。

4.根據權利要求2所述的金針菇J3673菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述步驟(3)中，所述PCR擴增，擴增體系為：總體積10μL，包括：10×PCR buffer 1μL，2.5mmol/L dNTP 0.8μL，5U/μL HSTaq DNA酶0.1μL，5μmol/L SSR標記正向引物和反向引物總體積各0.6μL，濃度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 1μL，ddH₂O 5.9μL；

PCR反應條件：95℃5min；95℃30second，59℃30second，72℃30second，35個循環；60℃30min。

5.根據權利要求2所述的金針菇J3673菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述步驟(4)中，所述將上述PCR擴增得到的產物與甲酰胺加樣緩沖液混勻，其中，加樣緩沖液的分子量內標與甲酰胺的體積比為0.5：8.5，所述加樣緩沖液的分子量內標與甲酰胺的體積共9μL；PCR擴增得到的產物加樣量1μL。

6.根據權利要求2所述的金針菇J3673菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述步驟(4)中，所述變性，為95℃變性3min，結束后置于冰水混合物中冷卻3min。