[發(fā)明專利]含氨基或羧基基團物質(zhì)標記的RBP抗體、人RBP免疫層析檢測試劑盒及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110269015.8
• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN113024669B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林斯;付瓊;韓艷華
• 申請（專利權(quán)）人: 北京華科泰生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K1/13;C12P21/08;C12P21/06;G01N33/532;G01N33/558;G01N33/577;G01N33/68
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 劉鐵生;孟阿妮

本發(fā)明涉及一種含氨基或羧基基團物質(zhì)標記的RBP抗體、人RBP免疫層析檢測試劑盒及其制備方法，所述含氨基或羧基基團物質(zhì)標記的抗體的制備方法，包括以下步驟：1)將RBP單克隆抗體溶于酸性緩沖液中，之后加入胃蛋白酶進行酶切反應(yīng)；2)將酶切后的混合溶液使用中性緩沖液透析過夜；3)將得到的液體通過Protein A親和純化，DEAE纖維素陰離子交換層析法純化獲得RBP?F(ab’)₂；4)將得到的液體通過Protein A親和純化，DEAE纖維素陰離子交換層析法純化獲得RBP?F(ab’)₂；5)將得到的抗體中間體與含氨基或羧基基團的物質(zhì)共價結(jié)合，得到含氨基或羧基基團物質(zhì)標記的RBP抗體。本發(fā)明的定向偶聯(lián)技術(shù)能減少補體對檢測試劑的影響，降低非特異性結(jié)合帶來的干擾。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于體外診斷領(lǐng)域，具體涉及一種含氨基或羧基基團物質(zhì)標記的RBP抗體、人RBP免疫層析檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

常用的檢測用抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，是一種IgG。當抗體結(jié)合抗原后，補體與抗體Fc段的補體結(jié)合位點結(jié)合，對檢測試劑造成干擾。此外，F(xiàn)c段的存在也可能使檢測試劑存在假性干擾。

另外，當前的抗體偶聯(lián)技術(shù)多采用共價偶聯(lián)。由于抗體表面含有豐富的氨基和羧基，這兩類基團也是抗體偶聯(lián)中使用最多的官能團。通常采用的策略是將固相如磁性微球，聚苯乙烯微球或者酶類等表面的羧基用EDC/NHS活化，再與抗體表面氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵。極少會采用EDC/NHS對抗體表面的羧基進行活化，因為抗體表面本身帶有氨基，容易產(chǎn)生自交聯(lián)的情況。由于氨基和羧基在抗體表面是普遍存在的，因此這種偶聯(lián)方法也是隨機的。當標記于抗體的互補決定區(qū)時，會使抗體失活。即使標記位于Fc段也會因空間位阻的存在造成免疫活性的降低。

視黃醇結(jié)合蛋白(Retinol-Binding Protein，RBP)是血液中維生素的轉(zhuǎn)運蛋白，由肝臟合成、廣泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中。測定視黃醇結(jié)合蛋白能早期發(fā)現(xiàn)腎小管的功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的損害程度，可作為腎功能早期損害和監(jiān)護治療的指標，還可作為肝功能早期損害和監(jiān)護治療的指標。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種含氨基或羧基基團物質(zhì)標記的RBP抗體、人RBP免疫層析檢測試劑盒及其制備方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種含氨基或羧基基團物質(zhì)標記的RBP抗體的制備方法，包括以下步驟：

1)將RBP單克隆抗體溶于酸性緩沖液中，之后加入胃蛋白酶進行酶切反應(yīng)；

2)將步驟1)酶切后的混合溶液使用中性緩沖液透析過夜；

3)步驟2)得到的液體通過Protein A親和純化，DEAE纖維素陰離子交換層析法純化獲得RBP-F(ab’)₂；

4)將步驟3)得到的RBP-F(ab’)2與HOOC-(CHCHO)n-NH2共價偶聯(lián)，形成抗體中間體；

5)將步驟4)得到的抗體中間體與含氨基或羧基基團的物質(zhì)共價結(jié)合，得到含氨基或羧基基團物質(zhì)標記的RBP抗體。

在本發(fā)明的一個具體方案中，其中步驟1)中，所述RBP抗體、胃蛋白酶與酸性緩沖液與的質(zhì)量比例為(0.5-1)：(0.5-1)：10000，優(yōu)選為1:1：10000。所述IgG抗體為能與抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體，能被胃蛋白酶切成F(ab’)2段，且保留結(jié)合抗原的活性。

在本發(fā)明的一個具體方案中，其中步驟1)中，所述酶切反應(yīng)的溫度為37℃-55℃，優(yōu)選為37℃，這是酶在37℃時的活性較好；所述酶切反應(yīng)的時間為0.5-2小時。優(yōu)選時間為30min，優(yōu)選時間下，反應(yīng)程度達到最高，時間再往后，趨于平穩(wěn)，30min既能充分反應(yīng)，又能節(jié)約試驗時間。