[發明專利]煙草多酚代謝途徑蛋白基因NtPPOE及其應用

在審

• 申請號: 202110268040.4
• 申請日: 2021-03-11
• 公開（公告）號: CN113151315A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 楊永鋒;王根發;劉向真;劉茂林;姚倩;趙森森;馬波波;劉超;王燃;金立鋒
• 申請（專利權）人: 河南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/82;A01H5/12;A01H6/82
• 代理公司: 北京維澳專利代理有限公司 11252
• 代理人: 王立民;曾晨

本發明涉及煙草多酚代謝途徑蛋白基因NtPPOE及其應用，該基因堿基序列如SEQ ID NO.1所示。煙草多酚代謝途徑NtPPOE由602個氨基酸殘基組成，包括三個保守功能域：178?388位第一個保守蛋白功能域，395?445位其第二個保守蛋白功能域，466?597為其第三個保守蛋白功能域。該蛋白基因NtPPOE與植物葉片中多酚中綠原酸含量高度負相關相關，降低該蛋白基因NtPPOE表達后，葉片中綠原酸含量顯著升高。本發明通過對特定煙草多酚代謝途徑蛋白基因NtPPOE的初步研究，發現其與綠原酸含量高度相關，在將該基因沉默后，煙草中綠原酸含量極顯著升高。基于這一特性，可為煙葉中多酚類物質含量調控煙草新品種培育一定的應用基礎和參考借鑒。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別是屬于煙草基因工程技術領域，具體涉及煙草多酚代謝途徑蛋白基因NtPPOE及其應用。

背景技術

煙葉原料是卷煙工業的基礎。近年來，我國煙葉原料生產整體水平有了明顯的提高，但是煙葉原料質量距卷煙工藝配方的需要還有一定的差距，尤其香氣品質不能滿足工業企業的需求。香氣優雅、風格突出的高檔次煙葉還有很大需求空間。烤煙中多酚類化合物含量與品質存在一致性關系，多酚類化合物積累直接影響烤煙的外觀質量和內在質量，有研究者提出將多酚物質含量與蛋白質氮含量比值作為“芳香值”，以此作為判斷煙葉中香氣吃味的數據標準，因此提高煙葉中多酚類物質含量對提升煙葉香氣品質具有重要意義。

煙葉多酚類物質含量很高，最多能達到干重的6％以上，其中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷是煙葉中含量最多的多酚類化合物，占煙草中多酚含量的80％以上，同時，僅僅綠原酸一種物質，就占到多酚的75-90％，因此，綠原酸是提高煙葉香氣的一個重要潛在物質。

然而多酚類物質屬于次生代謝物，傳統栽培技術措施無法對其含量進行有效調控。多酚在植物中受到多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)的基因調控，植物中的PPO基因多以基因家族形式存在(Beecher and Skinne，2001；Shetty et al.，2011；Arisas etal.，2012)。在茄科經濟作物中，茄子中找到個6個PPO基因(Shetty，2011)；番茄中發現7個PPO基因；馬鈴薯中有2個PPO基因；紅三葉草中找到至少6個PPO基因(Winters，2009)。Cai等(2013)發現高粱中存在8個不同的PPO基因；但葡萄藤中只發現一個PPO基因(Mayer，2006)。

PPO活性具有植物組織差異性。PPO廣泛存在于植物的多種器官中，如葉片、根、塊莖及花中，幼嫩部位含量較高而在成熟部位含量較低(謝春艷和賓金華,1999)。馬鈴薯中PPO在塊莖、根及花中含量較高，而在葉片中含量較低；PPO的活性隨著塊莖的發育不斷升高(Thygesen et al.,1995)。PPO活性在煙草苗期活性較高；進入旺長期后，葉片中PPO活性繼續升高；進入成熟期后，PPO活性逐漸下降；并且PPO活性呈現上部葉中部葉下部葉的規律(武德傳et al.,2006)。PPO活性受到外界環境的調控(Thygesen et al.,1995；武德傳etal.,2006；謝春艷和賓金華,1999)。嘎拉蘋果多酚氧化酶反應的最適pH值為6.0，最適反應溫度是45℃。Palma-Orozco(2012)從馬曼果中分離出兩種同工酶(PPO1和PPO2)，最適pH為7.0，最適溫度是35℃。Rahman(2012)從花椰菜中分離出一種PPO，最適pH為8.0，最適溫度為55℃。Han-Ju(2012)從油菜花中分離出的PPO最適pH為5.5，在60℃到70℃之間活性較為穩定。

通過調控PPO類基因表達量而調節煙葉中多酚類物質含量是一種理論上可行，現實中急需的一種提高煙葉香氣品質的有效技術手段。

發明內容

本發明的目的在于提供一種煙草多酚代謝途徑蛋白基因NtPPOE及其應用，從而調節煙葉中多酚類物質含量，從而為高香氣物質煙葉培育提供基礎。

本發明是通過以下技術方案實現的：