[發明專利]永生化飼養層細胞株的構建方法、永生化飼養層細胞株及應用在審
| 申請號： | 202110266099.X | 申請日： | 2021-03-11 |
| 公開（公告）號： | CN112941033A | 公開（公告）日： | 2021-06-11 |
| 發明（設計）人： | 鄒暢;張薈蓉;劉東成 | 申請（專利權）人： | 深圳市人民醫院 |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N15/12;C12N15/867;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463 | 代理人： | 張金銘 |
| 地址： | 518000 廣東省*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 永生 飼養 細胞株 構建 方法 應用 | ||
1.一種永生化飼養層細胞株的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括將至少兩種永生化基因導入飼養層細胞中，得到永生化飼養層細胞株。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述永生化基因包括c-MYC、bFGF、TERT、BMI-1或SV40 T。
3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述導入的方法包括，將重組質粒包裝成的病毒感染至飼養層細胞中，其中重組質粒載有永生化基因；
優選地，所述重組質粒采用的載體質粒包括慢病毒質粒和/或逆轉錄病毒質粒；
優選地，所述慢病毒質粒包括PLV-EF1a-Puro；
優選地，所述重組質粒包括pBABE-Puro-hTERT-HA質粒；
優選地，所述飼養層細胞來源于成纖維細胞。
4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，采用293T細胞將重組質粒包裝成病毒。
5.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述永生化基因包括BMI-1和hTERT；所述BMI-1插入慢病毒質粒。
6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述慢病毒質粒的包裝方法包括，將帶有BMI-1基因的慢病毒質粒、慢病毒原件PMD2G和PSPAX質粒按照質量比例5:2:3混合，利用PEI轉染到293T細胞中，收集上清即為慢病毒。
7.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述逆轉錄病毒質粒的包裝方法包括，將帶有hTERT基因的逆轉錄病毒質粒、逆轉錄病毒原件pRetro-Gal-Pol和pRetro-VSVG質粒按照質量比例10:7～9:1～2混合，利用PEI轉染到293T細胞中，收集上清即為逆轉錄病毒；
優選地，所述帶有hTERT基因的逆轉錄病毒質粒、逆轉錄病毒原件pRetro-Gal-Pol和pRetro-VSVG質粒的質量比例為10:9:1。
8.根據權利要求3～7任一項所述的構建方法，其特征在于，所述感染的方法包括將病毒與polybrene的混合液加入到opti-MEM中孵育后，滴加到飼養層細胞中培養，再將培養基更換為無病毒完全培養基，繼續培養，然后加入Puromycin進行陽性克隆篩選；
優選地，所述慢病毒和逆轉病毒的加入質量比例為1：1～3，優選為1：2；
優選地，所述polybrene的加入量為4～10μg/ml，優選為8μg/ml；
優選地，更換無病毒完全培養基前培養時間為24～26h；
優選地，更換無病毒完全培養基后繼續培養時間為72h；
優選地，所述Puromycin的加入量為1～3μg/ml，優選為2μg/ml。
9.采用權利要求1～8任一項所述的構建方法得到的永生化飼養層細胞株。
10.權利要求9所述的永生化飼養層細胞株在如下(A)～(C)中任一項的應用：
(A)評價藥物治療腫瘤或控制腫瘤細胞增殖效果；
(B)確定細胞增殖或衰老機理；
(C)人源原代組織細胞的功能鑒定。
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