[發明專利]犬流感病毒、犬冠狀病毒和犬呼腸孤病毒的三重PCR檢測方法

有效

• 申請號: 202110263120.0
• 申請日: 2021-03-11
• 公開（公告）號: CN115074461B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 劉惠莉;石迎;陶潔;李本強;程靖華
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

1.一種犬流感病毒、犬冠狀病毒和犬呼腸孤病毒的三重PCR檢測方法，包括以下步驟：

1）查找犬流感病毒CIV、犬冠狀病毒CCOV和犬呼腸孤病毒CRV的保守區序列；

2）根據GenBank上公布的CIV病毒的M基因、CCOV病毒的L1基因和CRV病毒的M基因序列信息，分別設計上下游引物對；所述CIV病毒的Gene?Bank序列號為KM594565.1；所述CRV病毒的Gene?Bank序列號為AY007384；所述CCOV病毒的Gene?Bank序列號為KP849472；

擴增CIV病毒的引物對序列如下：

CIV-F?5’-CTTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’；

CIV-R?5’-AGGGCATTTTGGACAAAGCGTCTA-3’；

擴增CCOV病毒的引物對序列如下：

CCOV-F?5’-GTGCTTCCTCTTGAAGGTACA-3’；

CCOV-R?5’-AGGGTAATGGGGTTGAAGAATGA-3’；

擴增CRV病毒的引物對序列如下：

CRV-F?5’-ATCGGGAATGCAGAATATGATCC-3’；

CRV-R?5’-GTTTCACTGTTCACCTTACCAGCA-3’；

3）進行三重PCR反應

以待測樣品為模板，以上述三組引物對序列為引物，進行三重PCR反應，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測；所述三重PCR反應過程為：94?℃預變性3?min，94?℃?變性30?s，50-60℃退火30?s，72?℃延伸30?s，共30-35個循環，72?℃延伸5?min；

PCR反應體系總體積為25μL，包括：2×PCR?Mix?12.?5?μL，濃度為10?μmol/L的CIV-F和CIV-R各0.5?μL；濃度為10?μmol/L的CRV-F和CRV-R?各0.5μL，濃度為10?μmol/L的CCOV-F和CCOV-R各0.25?μL，模板3?μL，加雙蒸水補足至25?μL；所述CIV病毒的擴增產物片段長度為244bp，CCOV病毒的擴增產物片段長度為333bp，CRV病毒的擴增產物片段長度為425bp。

2.一種權利要求1所述的三重PCR檢測方法進行檢測犬流感病毒、犬冠狀病毒和犬呼腸孤病毒的試劑盒，包括權利要求1的三重PCR反應體系和陽性對照物，所述陽性對照物由分別含有CIV、CRV和CCOV基因組片段的陽性質粒pEASY－I、pEASY－R和pEASY－C等量混合制得。