[發明專利]一種治療A型血友病的基因編輯系統及其應用

有效

• 申請號: 202110262182.X
• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN113025659B
• 公開（公告）日: 2023-01-10
• 發明（設計）人: 程濤;張健萍;趙梅;殷夢迪;李斯昂;趙娟娟;許靜;楊智學;張鳳;張孝兵
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所）
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N5/10;A61K48/00;A61P7/04
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種基因編輯系統，其特征在于，所述基因編輯系統包括CRISPR-SaCas9基因編輯載體和F8供體載體；

所述CRISPR-SaCas9基因編輯載體包括串聯的SaCas9編碼基因和sgRNA；

所述F8供體載體包括截短型F8基因，所述截短型F8基因為缺失了B結構域的F8基因；

所述sgRNA的靶基因包括Alb基因第11號內含子和/或Alb基因第13號內含子；

所述SaCas9編碼基因和所述sgRNA之間還包括Wpre；

所述Wpre和sgRNA的啟動子之間還包括PolyA或miR-142-3p靶序列；

所述sgRNA為SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25之一所示的核酸序列。

2.根據權利要求1所述的基因編輯系統，其特征在于，

所述SaCas9編碼基因的啟動子和所述sgRNA的啟動子不同；

所述SaCas9編碼基因的啟動子為肝細胞特異性啟動子；

所述sgRNA的啟動子為U6啟動子；

所述F8供體載體包括截短型F8基因和天門冬酰胺糖基化位點的融合基因；

所述F8供體載體在截短型F8基因上游還包括剪接受體序列；

所述剪接受體序列和截短型F8基因之間還包括自斷裂多肽基因；

所述F8供體載體在截短型F8基因下游還包括PolyA序列。

3.根據權利要求2所述的基因編輯系統，其特征在于，

所述肝細胞特異性啟動子為SEQ ID NO:31～33之一所示的核酸序列；

所述U6啟動子為SEQ ID NO:34所示的核酸序列；

所述Wpre為SEQ ID NO:35所示的核酸序列；

所述PolyA為SEQ ID NO:36所示的核酸序列；

所述miR-142靶序列為SEQ ID NO:37～39之一所示的核酸序列。

4.根據權利要求2所述的基因編輯系統，其特征在于，所述天門冬酰胺糖基化位點為SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；

所述截短型F8基因和天門冬酰胺糖基化位點的融合基因為SEQ ID NO:41所示的核酸序列；

所述剪接受體序列包括Alb第13號內含子的部分序列和第14號外顯子的部分序列；

所述剪接受體序列的長度為65～135bp；

所述剪接受體序列為SEQ ID NO:42～49之一所示的核酸序列；

所述自斷裂多肽基因為SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。

5.根據權利要求1-4任一項所述的基因編輯系統，其特征在于，所述CRISPR-SaCas9基因編輯載體和F8供體載體的空載體為腺相關病毒載體。

6.根據權利要求5所述的基因編輯系統，其特征在于，所述CRISPR-SaCas9基因編輯載體和F8供體載體的空載體為AAV2載體、AAV5載體、AAV6載體、AAV8載體或AAV9載體中的任意一種或至少兩種的組合。

7.根據權利要求6所述的基因編輯系統，其特征在于，所述CRISPR-SaCas9基因編輯載體和F8供體載體的空載體為AAV8載體。

8.一種腺相關病毒組合物，其特征在于，所述腺相關病毒組合物包括CRISPR-SaCas9基因編輯腺相關病毒和F8供體腺相關病毒；

所述CRISPR-SaCas9基因編輯腺相關病毒由轉染有權利要求1-7任一項所述的基因編輯系統中的CRISPR-SaCas9基因編輯載體和輔助質粒的哺乳動物細胞制備得到；

所述F8供體腺相關病毒由轉染有權利要求1-7任一項所述的基因編輯系統中的F8供體載體和輔助質粒的哺乳動物細胞制備得到；

所述腺相關病毒組合物中CRISPR-SaCas9基因編輯腺相關病毒和F8供體腺相關病毒的劑量比為1:(2.5～10)。