[發(fā)明專利]一種細(xì)菌耐氯性的快速評(píng)價(jià)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110260169.0
• 申請(qǐng)日: 2021-03-10
• 公開（公告）號(hào): CN113025683B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈瑞寶;逯南南;褚福敏;趙清華;孫韶華;王明泉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/06
• 分類號(hào): C12Q1/06;G01N15/14
• 代理公司: 濟(jì)南誠(chéng)智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司 37105
• 代理人: 馬祥明

本發(fā)明公開了一種細(xì)菌耐氯性的快速評(píng)價(jià)方法，先對(duì)細(xì)菌進(jìn)行馴養(yǎng)，利用流式細(xì)胞儀對(duì)馴養(yǎng)后的菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，制備適宜菌細(xì)胞濃度的污染樣品，然后進(jìn)行氯消毒試驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行消毒后菌細(xì)胞活性的檢測(cè)，最終計(jì)算細(xì)菌氯耐受指數(shù)值并根據(jù)耐氯性評(píng)價(jià)規(guī)則實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌耐氯性的評(píng)價(jià)。本發(fā)明將細(xì)菌劃分為活細(xì)胞、受損細(xì)胞、死細(xì)胞三個(gè)群體進(jìn)行計(jì)數(shù)，充分考慮了活的不可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)胞可能帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)引入氯耐受指數(shù)概念及計(jì)算方法，更加全面的量化評(píng)估了細(xì)菌的耐氯能力，大大縮短了耐氯性評(píng)價(jià)的時(shí)間。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域，涉及細(xì)菌耐氯性的快速評(píng)價(jià)方法，尤其是基于流式細(xì)胞術(shù)的供水系統(tǒng)中細(xì)菌耐氯性評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)

氯作為一種消毒技術(shù)在供水系統(tǒng)中被廣泛應(yīng)用，氯消毒過(guò)程也是對(duì)細(xì)菌耐氯性選擇的過(guò)程，供水系統(tǒng)中部分細(xì)菌對(duì)氯消毒劑產(chǎn)生了抗性后能夠在含有較高余氯濃度的自來(lái)水廠、管網(wǎng)系統(tǒng)中存活，這部分細(xì)菌被稱為“耐氯性細(xì)菌”或“耐氯菌”。

供水系統(tǒng)中耐氯菌的存在是研究者們一直關(guān)注的問(wèn)題，水源、管網(wǎng)等均有耐氯菌檢出的報(bào)道。供水系統(tǒng)中耐氯菌的存在可引起多方面的危害：(1)部分耐氯菌為致病菌或者條件致病菌；(2)細(xì)菌氯耐受性與抗生素耐藥性之間存在相關(guān)性；(3)配水系統(tǒng)中的耐氯菌會(huì)導(dǎo)致管道腐蝕和生物膜過(guò)度生長(zhǎng)；(4)耐氯菌的過(guò)度繁殖導(dǎo)致膜工藝處理系統(tǒng)效率降低、能耗增加和結(jié)構(gòu)部件使用壽命縮短等問(wèn)題。

目前，耐氯菌通常被定義為具有高抗氯消毒能力的細(xì)菌或能在余氯中存活甚至再生的細(xì)菌，是一個(gè)相對(duì)的概念。耐氯菌的科學(xué)定義和抗氯能力的量化方法至今為止未達(dá)成共識(shí)。WHO于2011年提出了一種評(píng)估病原微生物耐氯性的方法，該方法基于微生物在常規(guī)消毒劑量(0.5mg/L游離氯)下的存活時(shí)間。專利“一種細(xì)菌耐氯性的評(píng)估方法”(ZL201811024489.0)提出了以消毒劑濃度和反應(yīng)時(shí)間的乘積(CT值，mg·min/L)為指標(biāo)進(jìn)行耐氯性評(píng)估的方法。也有研究提出以對(duì)數(shù)滅活率作為評(píng)價(jià)細(xì)菌耐氯性的指標(biāo)，這些方法均采用培養(yǎng)法進(jìn)行耐氯性細(xì)菌的培養(yǎng)，存在以下兩方面的問(wèn)題：(1)多采用低溫、貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)條件，耗時(shí)較長(zhǎng)；(2)消毒過(guò)程中存在大量活的不可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)的細(xì)菌，傳統(tǒng)培養(yǎng)法無(wú)法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，往往忽略了該部分受損菌體可能帶來(lái)的危害。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種細(xì)菌耐氯性的快速評(píng)價(jià)方法，為供水系統(tǒng)中耐氯性細(xì)菌的篩查及耐氯性的量化評(píng)估提供支撐。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明先對(duì)細(xì)菌進(jìn)行馴養(yǎng)，利用流式細(xì)胞儀對(duì)馴養(yǎng)后的菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，制備適宜菌細(xì)胞濃度的污染樣品，然后進(jìn)行氯消毒試驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行消毒后菌細(xì)胞活性的檢測(cè)，最終計(jì)算細(xì)菌氯耐受指數(shù)值并根據(jù)耐氯性評(píng)價(jià)規(guī)則實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌耐氯性的評(píng)價(jià)。

(1)菌的馴養(yǎng)：將凍存管中保存的菌液加入5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃震蕩培養(yǎng)24h，對(duì)凍存的菌株進(jìn)行復(fù)蘇；以菌株原生長(zhǎng)環(huán)境水體作為細(xì)菌馴養(yǎng)基質(zhì)液，對(duì)待評(píng)價(jià)菌株進(jìn)行馴養(yǎng)，得到馴養(yǎng)的菌液；若原生長(zhǎng)環(huán)境水體難以獲得，以無(wú)菌磷酸鹽PBS緩沖液作為替代馴養(yǎng)基質(zhì)液；

(2)氯消毒試驗(yàn)：步驟(1)馴養(yǎng)的菌液經(jīng)離心收集菌細(xì)胞，使用稀釋基質(zhì)制備成菌懸液，流式細(xì)胞儀上機(jī)分析計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋制備消毒用工作菌液，加入氯消毒劑進(jìn)行消毒試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)束加入足量反應(yīng)終止劑至去除殘留余氯；

(3)菌細(xì)胞濃度計(jì)算：步驟(2)終止反應(yīng)后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行消毒后菌液細(xì)胞活性的檢測(cè)，按照活性將菌細(xì)胞分為活體菌、死亡菌以及受損菌三個(gè)群體，按照公式(1)計(jì)算消毒后菌細(xì)胞濃度：

N＝C_L+C_I×50％ (公式1)

式中：N-消毒后菌細(xì)胞濃度；

C_L-活體菌細(xì)胞濃度，cells/mL；

C_I-受損菌菌細(xì)胞濃度，cells/mL；