[發(fā)明專利]基于超疏水微陣列芯片的類器官原位玻璃化凍存方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110258595.0
• 申請(qǐng)日: 2021-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN112841177B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙添;王憲寧;陳曉芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 奧格諾德生物科技（北京）有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 北京漢鼎理利專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11618
• 代理人: 潘滿根

本發(fā)明提供一種基于超疏水微陣列芯片的類器官原位玻璃化凍存方法，所述方法包括：制備超疏水微坑陣列芯片，將混有類器官的基質(zhì)膠接種到所述超疏水微坑陣列芯片上每個(gè)微坑中；在所述基質(zhì)膠凝固后，將類器官培養(yǎng)基加入到每個(gè)微坑中；和玻璃化凍存。本發(fā)明方法省去了復(fù)蘇時(shí)需要將類器官重新培養(yǎng)再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的步驟和時(shí)間，能夠提高類器官的活性并減少操作過程中的損失。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基于超疏水微陣列芯片的類器官原位玻璃化凍存方法。

背景技術(shù)

類器官屬于三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)物，包含其代表器官的一些關(guān)鍵特性，在臨床研究和基礎(chǔ)研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。但是類器官的長(zhǎng)期保存依然是一個(gè)限制其發(fā)展的一個(gè)潛在問題。為了長(zhǎng)時(shí)間保存細(xì)胞的活力和初始特性，最常用的方法是冷凍保存。為了冷凍保存各種類型的細(xì)胞，組織，胚胎和類器官，科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)了許多慢速冷凍方法。到目前為止，大多數(shù)生物庫(kù)的低溫存儲(chǔ)類器官都采用傳統(tǒng)的慢速冷凍方法。常規(guī)慢凍方法是指將類器官在常規(guī)凍存管中進(jìn)行慢凍。首先將類器官進(jìn)行消化回收，離心去上清后用培養(yǎng)基進(jìn)行重懸；再次離心去上清，加入凍存液(例如，70％培養(yǎng)基+20％胎牛血清+10％二甲基亞砜)。之后將凍存管轉(zhuǎn)移到程序降溫凍存盒，將凍存盒放置在-80℃冰箱中進(jìn)行程序降溫，最后轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期保存。常規(guī)慢凍使用低濃度的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行凍存，由于類器官是三維培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)，從而使得低濃度凍存液無法快速滲入類器官內(nèi)部，在凍存和解凍時(shí)，內(nèi)部細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生冰晶最后導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

類器官中細(xì)胞之間的強(qiáng)粘附力使低濃度冷凍保存劑(CPA)難以滲透到此類3D培養(yǎng)物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，這可能導(dǎo)致在類器官內(nèi)部的細(xì)胞由于無法充分接觸CPA導(dǎo)致其死亡并在解凍時(shí)破壞類器官的結(jié)構(gòu)。有研究證明將類器官切成小塊，進(jìn)行凍存有利于冷凍液的充分滲透，但這樣也導(dǎo)致了更加繁瑣的操作步驟以及破壞類器官結(jié)構(gòu)等問題。

近年來，科學(xué)家對(duì)類器官的玻璃化凍存技術(shù)也進(jìn)行了很多研究，并顯示出廣闊的應(yīng)用前景。常規(guī)玻璃化凍存方法是指在常規(guī)凍存管中進(jìn)行類器官玻璃化凍存。該方法首先要將類器官?gòu)幕|(zhì)膠中消化回收，離心重懸后用培養(yǎng)基清洗化膠試劑；在用玻璃化平衡液孵育細(xì)胞，再次離心，去除平衡液；加入凍存液后快速轉(zhuǎn)移到凍存管中，短暫孵育，然后直接放入液氮中長(zhǎng)期保存。此技術(shù)需要將類器官進(jìn)行消化回收，并經(jīng)過多次離心去上清步驟，類器官?gòu)?fù)蘇過程中同樣要進(jìn)行多次的離心重懸，這些操作會(huì)不可避免的導(dǎo)致類器官數(shù)量上的損失，使得珍稀樣本數(shù)量減少，無法進(jìn)行后續(xù)的高通量藥敏實(shí)驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供基于超疏水微陣列芯片的類器官原位玻璃化凍存方法，所述方法包括：

步驟1：制備超疏水微坑陣列芯片，所述超疏水微坑陣列芯片包括微坑陣列和超疏水涂層池，所述微坑陣列的微坑直徑在300-1500μm，微坑深度為小于500μm和微坑間距為1500-3000μm；和所述超疏水涂層池的深度為大于50μm，所述涂層池與所述微坑之間的微坑壁厚為50-300μm，所述微坑陣列的微坑之間形成超疏水層，所述超疏水層是指其表面與水或水溶液的接觸角大于150°、滾動(dòng)角小于10°的疏水層；

步驟2：將混有類器官的基質(zhì)膠接種到所述超疏水微坑陣列芯片上每個(gè)微坑中；

步驟3：在所述基質(zhì)膠凝固后，將類器官培養(yǎng)基加入到每個(gè)微坑中；

步驟4：玻璃化凍存時(shí)，先去除掉培養(yǎng)基，之后在基質(zhì)膠頂部添加玻璃化平衡緩沖液，孵育10秒-30分鐘，孵育后除去玻璃化平衡緩沖液，每個(gè)微坑中加入玻璃化凍存溶液，液體交換10秒-30分鐘后，將所述超疏水微坑陣列芯片密封并直接儲(chǔ)存在液氮中。

在一種實(shí)施方式中，在步驟3中，將所述類器官培養(yǎng)基使用自動(dòng)點(diǎn)樣儀在玻片上點(diǎn)樣，形成與所述微孔對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基液滴，使用微型對(duì)準(zhǔn)儀將所述玻片與所述芯片對(duì)準(zhǔn)，完成所述類器官培養(yǎng)基的加液。

在一種實(shí)施方式中，在步驟4中，通過濾紙去除掉所述類器官培養(yǎng)基和/或所述玻璃化平衡緩沖液。