[發明專利]一種檢測紫外照射后基因組損傷的方法

有效

• 申請號: 202110257633.0
• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN112626183B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 至微生物智能科技（廈門）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/02
• 代理公司: 北京華創智道知識產權代理事務所(普通合伙) 11888
• 代理人: 彭隨麗

1.一種檢測紫外照射后基因組損傷的方法，其特征在于，通過雙通道TaqMan探針熒光定量PCR技術檢測微生物基因組損傷，包括以下反應步驟：

步驟1，用相應培養基培養得到所需微生物培養液；

步驟2，定量取得一定體積所述微生物培養液作為第一培養液，不做額外處理；定量取得一定體積所述微生物培養液作為第二培養液，在一定紫外強度下照射一段時間；

步驟3，向所述第一培養液和第二培養液分別加入裂解原料配制成裂解混合溶液，分別裂解3-10min，在轉速6000-10000 rpm下離心5-10 min，獲得所述第一培養液和第二培養液的上清液；所述第一培養液上清液作為第一對照組雙通道TaqMan探針熒光定量PCR的模板；所述第二培養液上清液作為第一實驗組雙通道TaqMan探針熒光定量PCR的模板；

步驟4，分別量取定量的步驟3中所述第一對照組的PCR模板，分為相同體積的若干子組并分別加入獨立的PCR擴增反應體系中；任一個加入所述第一對照組的模板的PCR擴增反應體系內同時進行長片段和短片段的擴增；所述PCR擴增反應體系組成包括，10X濃度的Taqbuffer、1-5mM的Mg2+鹽、0.2-0.4uM的第一探針、0.2-0.4 uM的第二探針、0.2mM的dNTPs、0.2-0.4 uM的短片段引物對P1、0.2-0.4uM的長片段引物對P2、適量的DNA聚合酶及滅菌水；所得各子組PCR擴增反應體系反應產物共同構成所述第一對照組；所述短片段長度為60-300bp；所述長片段長度為1000-2500bp；

步驟5，分別量取定量的步驟3中所述第一實驗組的PCR模板，分為相同體積的若干子組并分別加入獨立的PCR擴增反應體系中；任一個加入所述第一實驗組的模板的PCR擴增反應體系內同時進行長片段和短片段的擴增；所述PCR擴增反應體系組成包括，10X濃度的Taqbuffer、1-5mM的Mg2+鹽、0.2-0.4uM的第一探針、0.2-0.4 uM的第二探針、0.2mM的dNTPs、0.2-0.4 uM的短片段引物對P1、0.2-0.4uM的長片段引物對P2、適量的DNA聚合酶及滅菌水；所得各子組PCR擴增反應體系反應產物共同構成所述第一實驗組；

步驟6，使用所述雙通道探針采集所述第一對照組和所述第一實驗組中各子組的熒光信號CT值；

步驟7，所述第一對照組各子組的CT差值計算方法為ΔCTCK=CT長-CT短；所述第一實驗組各子組的CT差值計算方法為ΔCTuv = CT長-CT短；根據ΔΔCT= ΔCTuv-ΔCTCK-判斷所述第一實驗組各子組微生物基因組DNA損傷程度；其中所述ΔCTCK-為第一對照組各子組數值的平均值。

2.根據權利要求1所述的一種檢測紫外照射后基因組損傷的方法，其特征在于，步驟2所述紫外照射強度為10-30000uw/cm2；所述照射時間為0.5-100秒。

3.根據權利要求1所述的一種檢測紫外照射后基因組損傷的方法，其特征在于，所述裂解混合溶液含有10 mM ph=8.0的Tris-HCL和1%的Triton X-100。

4.根據權利要求1所述的一種檢測紫外照射后基因組損傷的方法，其特征在于，所述第一探針特異性作用于所述短片段引物對P1所擴增的片段；所述第二探針特異性作用于所述長片段引物對P2所擴增的片段。

5.根據權利要求1所述的一種檢測紫外照射后基因組損傷的方法，其特征在于，還包括：當步驟7所述ΔΔCT≥L時，確定所述第一實驗組微生物基因組受到損傷；當ΔΔCTL時，確定所述第一實驗組微生物基因組未受到損傷；所述L為檢出限L＝(K*s)/b，所述b為最低響應值/循環數，所述K為置信系數，s為第二對照組各子組標準偏差。