[發明專利]一種微生物活菌計數方法

在審

• 申請號: 202110257103.6
• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN112877461A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 朱保慶;衛博;陳卓君;王杰;林果;張柏林
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/645;C12R1/01
• 代理公司: 北京蕙識同聯專利代理事務所(特殊普通合伙) 11966
• 代理人: 張林

1.一種微生物活菌計數方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)樣本處理：樣本去雜，清洗后得菌體懸液；

(2)疊氮溴化丙錠處理：向菌體懸液中加入疊氮溴化丙錠溶液混勻孵育，離心制備菌懸液；

(3)實時熒光定量PCR檢測：以上述菌懸液為模板，直接進行實時熒光定量PCR檢測，所述菌懸液不經DNA提取步驟；

(4)活菌計數：基于標準曲線計算酵母活菌濃度。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物為酵母菌和/或乳酸菌；優選的，所述微生物為釀酒酵母和/或植物乳桿菌；更優選的，所述樣本為果酒樣本。

3.根據權利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的疊氮溴化丙錠終濃度為25-50μM，優選為25μM。

4.如權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的孵育采用置于冰上避光并利用搖床進行孵育；優選的，冰上避光孵育10-30min，鹵素燈曝光5-15min后，離心收集菌體；更優選的，先冰上避光，在搖床上以200rpm，孵育20min，然后用465nm鹵素燈曝光10min。

5.如權利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，當所述微生物為酵母菌時，步驟(2)進一步包括溶壁酶處理；優選的，所述溶壁酶處理時間為45min，處理濃度為75U/mL。

6.根據權利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中實時熒光定量PCR所用的特異性引物的序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.7-8所示。

7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的清洗為：1mL生理鹽水洗一次，1mL含2％(w/v)Polyvidone 25的10％TEN緩沖液洗一次，1mL生理鹽水洗一次后300μl生理鹽水重懸。

8.權利要求1-7任一所述的方法在監測酵母菌和/或乳酸菌活菌數中的用途。

9.一種酵母菌和/或乳酸菌活菌計數的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包含疊氮溴化丙錠、檢測引物及實時熒光定量PCR檢測的常規試劑；所述檢測引物的序列如SEQID NO.1-2所示和/或SEQ ID NO.7-8所示。

10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包含濃度為25-50μM，優選為25μM的疊氮溴化丙錠。