[發明專利]非洲豬瘟病毒P72基因熒光探針PCR檢測引物探針組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202110256899.3
• 申請日: 2021-03-09
• 公開（公告）號: CN112877476A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 翁長仁;邱龍新
• 申請（專利權）人: 龍巖學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 泉州市立航專利代理事務所(普通合伙) 35236
• 代理人: 姚婉莉

本公開提供了一種非洲豬瘟病毒P72基因熒光探針PCR檢測引物探針組，所述引物探針組的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其中，所述特異性熒光探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。本公開還提供了一種非洲豬瘟病毒P72基因熒光探針PCR檢測試劑盒及方法。本公開的試劑盒及其檢測方法具有覆蓋范圍廣，檢測時間短，檢測效率高，可用于豬的唾液、鼻腔拭子、血液、組織等樣本中的非洲豬瘟病毒檢測。

技術領域

本公開涉及生物技術的領域，尤其涉及一種非洲豬瘟病毒P72基因 熒光探針PCR檢測引物探針組、試劑盒及方法。

背景技術

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種急性、烈性、出血性、 高度接觸性傳染病，強毒株可在感染后約5-14天內致死家豬，致死率接 近100％。由于非洲豬瘟病毒具有復雜的免疫逃避機制，缺乏典型的中和 抗體，沒有有效的疫苗用于防疫，且無特效治療藥物，所以建立一種快 速、準確的檢測方法對及時有效防控非洲豬瘟顯得尤為重要。研發可檢 測盡可能多的毒株的檢測方法必不可少。

目前，市面上已經有用于非洲豬瘟病毒核酸檢測的操作簡單、快速 方便的實時熒光定量PCR試劑盒，已經被廣泛應用于非洲豬瘟病毒基因 檢測。但是，這些試劑盒的或是檢測靈敏度不足；或是基于個別毒株設 計的引物探針，只能檢測為數不多的病毒毒株。有鑒于此，本發明人研 究和設計出了一種非洲豬瘟病毒P72基因熒光探針PCR檢測引物、試劑盒及方法。

發明內容

本公開提供了一種非洲豬瘟病毒P72基因熒光探針PCR檢測引物探 針組、試劑盒及方法，在擴大檢測覆蓋毒株數的同時，以提高檢測靈敏 度。

根據本公開的一個方面，一種非洲豬瘟病毒P72基因熒光探針PCR 檢測引物探針組，所述引物探針組的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特異性熒光探針的核 苷酸序列如SEQ ID No.3，其中，所述特異性熒光探針的5’端標記有熒 光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

根據本公開的至少一個實施方式，所述特異性熒光探針的熒光報告 基團選自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460 中的一種，熒光淬滅基因選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的 一種。

根據本公開的一個方面，一種非洲豬瘟病毒P72基因熒光探針PCR 檢測試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的引物探針組。

根據本公開的至少一個實施方式，所述試劑盒還包括2×Taq PCR Mix。

根據本公開的至少一個實施方式，所述試劑盒還包括陰性對照及陽 性對照。

根據本公開的至少一個實施方式，所述陰性對照為雙蒸水。

根據本公開的至少一個實施方式，所述陽性對照為含P72基因的克 隆質粒，所述克隆質粒為pUC19；所述P72基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

根據本公開的一個方面，一種非洲豬瘟病毒P72基因熒光探針PCR 檢測方法，提取待測樣本的DNA，以待測樣本的DNA為模板，采用上所述 的試劑盒進行實時熒光PCR反應，根據實時熒光PCR擴增曲線分析待測 樣本，確定待測樣本是否存在非洲豬病病毒P72基因。

根據本公開的至少一個實施方式，所述實時熒光PCR反應體系為： PCR擴增的反應總體積為25μl，其中包括12.5μl的2×Taq PCR Mix， 1.25μl的10μM正向引物和1.25μl的10μM反向引物，0.5ul的10μM 特異性熒光探針，5μl的模板核酸樣本，4.5μl的超純水。