[發(fā)明專利]基因在間甲酚合成中的應(yīng)用、質(zhì)粒及菌株

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110255197.3
• 申請(qǐng)日: 2021-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN113073109B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高書山;安春艷;王偉;姚永鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N1/15;C12N15/54;C12N15/60;C12P7/22;C12R1/66
• 代理公司: 北京律和信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11446
• 代理人: 劉興;武玉琴

本發(fā)明涉及微生物合成領(lǐng)域，特別涉及基因在間甲酚合成中的應(yīng)用、質(zhì)粒及菌株。本發(fā)明以高產(chǎn)間甲酚的工業(yè)生產(chǎn)菌株為目標(biāo)，將來源于棒曲霉的生物合成基因patK和patG，在構(gòu)巢曲霉中進(jìn)行共表達(dá)，得到菌株AnCR05，成功實(shí)現(xiàn)了間甲酚的異源表達(dá)，產(chǎn)量在搖瓶水平達(dá)到0.2g/L。通過構(gòu)建不同排列組合的啟動(dòng)子的和基因，及增加基因拷貝數(shù)，構(gòu)建了菌株AnCR16，使得間甲酚異源表達(dá)產(chǎn)量達(dá)到了2.0g/L。本發(fā)明構(gòu)建的菌株為間甲酚的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的表達(dá)體系。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物合成領(lǐng)域，特別涉及基因在間甲酚合成中的應(yīng)用、質(zhì)粒及菌株。

背景技術(shù)

間甲酚適用于合成具有高市場(chǎng)價(jià)值的多種化學(xué)品，在工業(yè)上運(yùn)用廣泛。其主要用于農(nóng)藥中間體，生產(chǎn)殺蟲劑，也運(yùn)用于增塑劑和香料的中間體。因此高產(chǎn)量生產(chǎn)間甲酚對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)具有很實(shí)用的應(yīng)用價(jià)值。

由于間甲酚具有抗真菌和抗菌活性，它也被用作消毒劑和防腐劑(Puel等人，2010)。此外，作為精細(xì)化工行業(yè)中最重要的材料之一，它已被用于醫(yī)藥，農(nóng)用化學(xué)品，香料和染料的生產(chǎn)。眾所周知，間甲酚是維生素E，百里香酚，薄荷醇，巰基甲烷，倍硫磷，芐氯菊酯，抗氧化劑CA，二苯胺(DPA)，樹脂增塑劑，壓敏燃料和電子配子等的前體，因此可生產(chǎn)m-甲酚直接影響這些廣泛使用的產(chǎn)品的供應(yīng)和價(jià)格。對(duì)于間甲酚生產(chǎn)，主流技術(shù)包括從煤焦油中提取和化學(xué)方法，例如甲苯氯化水解法和異丙苯酸解法以獲得甲酚。這些方法具有明顯的缺陷，即，從鄰，對(duì)和間甲酚的混合物中分離間甲酚的繁瑣但必要的步驟，副產(chǎn)物，環(huán)境污染，低生產(chǎn)率和高成本。

間甲酚主要是通過化學(xué)方法從化石資源中生產(chǎn)的，必須采用額外的純化步驟將其與鄰、對(duì)甲酚混合物分離。由于化石資源儲(chǔ)量的局限性和對(duì)綠色環(huán)境保護(hù)的關(guān)注，對(duì)甲酚的化學(xué)合成是不可持續(xù)的，因此需要由可再生資源進(jìn)行生物技術(shù)生產(chǎn)。

許多青霉和曲霉菌可以天然合成間甲酚，由于其天然真菌宿主的產(chǎn)量低和遺傳途徑限制，產(chǎn)量較低。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了基因在間甲酚合成中的應(yīng)用、質(zhì)粒及菌株。將來源于棒曲霉的生物合成基因patk和patG，在構(gòu)巢曲霉中進(jìn)行共表達(dá)，得到菌株AnCR05，成功實(shí)現(xiàn)了間甲酚的異源表達(dá)，產(chǎn)量在搖瓶水平達(dá)到0.2g/L。通過構(gòu)建不同排列組合的啟動(dòng)子的和基因，及增加基因拷貝數(shù)，構(gòu)建了菌株AnCR16，使得間甲酚異源表達(dá)產(chǎn)量達(dá)到了2.0g/L。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了patk和patG的共表達(dá)在合成間甲酚中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自amyB、gpdA或glaA。

本發(fā)明還提供了patk和patG的共表達(dá)、且patk和/或patG的過表達(dá)在合成間甲酚中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自amyB、gpdA或glaA。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，patk與patG拷貝數(shù)的比例為(1～3)∶(1～3)。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，patK與patG拷貝數(shù)的比例為1∶1、2∶1、3∶1、3∶2或3∶3。

為了實(shí)現(xiàn)上述方案，本發(fā)明提供了包含patK和/或patG的質(zhì)粒。