[發明專利]一種構建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法及應用有效
| 申請號： | 202110251526.7 | 申請日： | 2021-03-08 |
| 公開（公告）號： | CN112899279B | 公開（公告）日： | 2023-02-14 |
| 發明（設計）人： | 李明定;韓海軍 | 申請（專利權）人： | 浙江大學 |
| 主分類號： | C12N15/113 | 分類號： | C12N15/113;C12N15/55;C12N15/85;C12N15/89;A01K67/027 |
| 代理公司： | 杭州求是專利事務所有限公司 33200 | 代理人： | 應孔月 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 構建 fzd6 基因 小鼠 模型 方法 應用 | ||
1.一種構建
（1）確定小鼠待敲除基因的特異性靶位點，針對小鼠
（2）使用所述的sgRNA構建sgRNA/Cas9表達載體；
（3）將所述的sgRNA/Cas9表達載體線性化并純化后，體外轉錄合成sgRNA和Cas9 mRNA；
（4）將上述sgRNA和Cas9 mRNA一起顯微注射到小鼠的受精卵中；
（5）將注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠中，出生的小鼠即F0代小鼠，通過PCR反應和Sanger測序確認是野生型小鼠或陽性雜合子小鼠；
（6）取鑒定后的F0代野生型小鼠和陽性雜合子小鼠進行回交，獲得單一基因型的雜合子小鼠，然后在雜合子小鼠之間雜交繁育獲得純合子個體，此即所構建的
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，（2）中構建sgRNA/Cas9表達載體，具體為：
（1）對sgRNA序列設計特異性引物，包括sgRNA正向引物和sgRNA反向互補引物；
（2）將設計好的 sgRNA以梯度降溫的方式退火成雙鏈后與質粒連接、轉化、涂板，然后置于37℃細菌培養箱中孵育過夜，第二天挑取單克隆并接種于LB 培養液中，在37℃恒溫搖床中培養過夜，之后收集菌液進行質粒提取，同時進行PCR鑒定陽性克隆。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA正向引物序列為SEQ IDNO.2，sgRNA反向互補引物序列為SEQ ID NO.3。
4.構建
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還含有Cas9 mRNA。
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