[發(fā)明專利]基于CRISPR/Cas9構(gòu)建Fzd6-Q152E定點(diǎn)突變小鼠模型的方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110251516.3
• 申請(qǐng)日: 2021-03-08
• 公開（公告）號(hào): CN112980880B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明定;韓海軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 應(yīng)孔月

本發(fā)明公開了基于CRISPR/Cas9構(gòu)建Fzd6?Q152E定點(diǎn)突變小鼠模型的方法及應(yīng)用，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同物種中rs61753730所在的位置有一定的保守性，因此，在小鼠中靶向rs61753730所在的位置，即Q152E，設(shè)計(jì)并合成sgRNA、對(duì)應(yīng)的引物以及Donor序列，構(gòu)建sgRNA/Cas9表達(dá)載體，并將其線性化和純化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，然后將sgRNA、Cas9mRNA以及Donor混合，一起顯微注射到小鼠受精卵中，再將存活的受精卵移植到假孕母鼠子宮中，出生的小鼠為被編輯的F0代小鼠。經(jīng)PCR和Sanger測(cè)序鑒定，將陽(yáng)性的小鼠與野生型小鼠進(jìn)行交配，獲得F1代小鼠，最后將經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的F1代雜合子小鼠進(jìn)行交配，繁育所得后代即可獲得純合的Fzd6?Q152E突變型和野生型的小鼠。該模型小鼠可用于研究rs61753730的生物學(xué)功能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)研究領(lǐng)域，尤其涉及一種基于CRISPR/Cas9構(gòu)建Fzd6-Q152E定點(diǎn)突變小鼠模型的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性(Single?nucleotide?polymorphism，SNP)，是第三代遺傳標(biāo)記，主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列的多態(tài)性，即在基因組特定核苷酸位置發(fā)生兩種不同核苷酸的改變，有的改變會(huì)引起所編碼的氨基酸的不同。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個(gè)堿基對(duì)中就有一個(gè)，并且這種核苷酸變異是人類可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種，其在疾病的遺傳學(xué)研究中有重要意義，因此，深入挖掘SNP并研究其生物學(xué)功能至關(guān)重要。

Rs61753730是一個(gè)位于人第8號(hào)染色體Frizzled?6(FZD6)基因上的SNP，位置為Chr.8:103324560，有兩個(gè)等位位點(diǎn)，分別為C和G，屬于錯(cuò)義突變，即在FZD6所翻譯的氨基酸的第152位由谷氨酰胺(Glutamine，Gln或Q)轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?Glutamic?acid，Gln或E)，因此該位點(diǎn)也被稱為Q152E位點(diǎn)。已有研究證實(shí)FZD6參與了抑郁癥、血液病、毛發(fā)的發(fā)育、神經(jīng)管畸形以及癌癥等的發(fā)展及進(jìn)程。目前，也有研究發(fā)現(xiàn)rs61753730可能參與人類抑郁癥的形成以及其他精神類疾病，但缺乏該位點(diǎn)被編輯的小鼠模型。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例的目的是提供一種基于CRISPR/Cas9構(gòu)建Fzd6-Q152E定點(diǎn)突變小鼠模型的方法及應(yīng)用，該方法利用最新的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠Fzd6基因的Q152E位置進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功構(gòu)建了Fzd6-Q152E定點(diǎn)突變小鼠模型。該模型可以幫助研究人員深入探索Fzd6-Q152E在攜帶rs61753730突變的疾病中的遺傳學(xué)作用提供有效的研究途徑和方法。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第一方面，提供一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建Fzd6-Q152E點(diǎn)突變小鼠模型的方法，包括：

(1)確定待突變的位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于小鼠Fzd6基因第四個(gè)外顯子，然后使用在線的CRISPR?Design工具設(shè)計(jì)sgRNA以及對(duì)應(yīng)的引物和同源修復(fù)模板Donor序列，所述的sgRNA序列為SEQ?ID?NO.1，引物序列包括SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4，Donor序列為SEQ?ID?NO.5；

(2)使用上述設(shè)計(jì)的sgRNA，退火形成雙鏈DNA，構(gòu)建sgRNA/Cas9表達(dá)載體，并將其線性化和純化后，作為模板用于體外轉(zhuǎn)錄；

(3)將sgRNA、Cas9?mRNA以及Donor混合，通過(guò)顯微注射一起注射到小鼠受精卵，然后將注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠子宮中，出生的小鼠為被編輯的F0代小鼠；

(4)通過(guò)PCR方法和測(cè)序鑒定將所述F0代小鼠劃分為野生型小鼠或陽(yáng)性雜合子小鼠，然后將所述陽(yáng)性雜合子小鼠與所述野生型小鼠進(jìn)行交配，獲得F1代小鼠，再次通過(guò)PCR反應(yīng)和測(cè)序進(jìn)行鑒定后，被鑒定為陽(yáng)性的F1代雜合子小鼠即可穩(wěn)定遺傳，然后在F1代雜合子小鼠之間進(jìn)行雜交，繁育所得后代即可獲得純合突變型和野生型個(gè)體。