[發(fā)明專利]天然麝香中特征多肽的檢測方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110251483.2
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN113049695B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣珍珍;于娟;宋月林;屠鵬飛;劉文靜
• 申請（專利權(quán)）人: 漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 李雁翔;秦彥蘇

1.一種天然麝香中特征多肽的檢測方法，其特征在于：所述特征多肽的序列如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.8所示；所述天然麝香包括養(yǎng)殖麝香或野生麝香中的至少一種；所述方法為液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法，包括：

1)供試品溶液制備：分別精密稱取麝香樣品約200～1000mg，加入5～25mL二氯甲烷，超聲提取，抽濾，去除溶液，重復(fù)上述步驟；所得殘渣繼續(xù)加入6～30mL乙醇，超聲提取，抽濾，去除溶液，重復(fù)上述步驟；用5～25mL水對所剩殘渣繼續(xù)進(jìn)行提取，超聲，抽濾，取上清溶液，重復(fù)上述步驟；將提取所得的水提物上清溶液混合，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，稱取提取物重量，加水配成10～50mg/mL的麝香提取物溶液；

取含蛋白400μg～800μg的麝香提取物溶液加入TCEP使其終濃度為10mM，進(jìn)行二硫鍵還原處理，恢復(fù)室溫后，加入碘代乙酰胺使其終濃度為15mM，進(jìn)行烷基化；將烷基化樣品轉(zhuǎn)移至超濾管中，加入8M尿素，離心，棄去超濾液；再加入50mM碳酸氫銨，離心，棄去超濾液；在超濾管中加入胰酶進(jìn)行酶解，收集超濾液，即得麝香酶解溶液，取酶解樣品，加入內(nèi)標(biāo)，作為麝香供試品溶液；

2)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和所述麝香供試品溶液，按以下色譜條件與質(zhì)譜條件進(jìn)行液相-質(zhì)譜檢測，對麝香中的如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽進(jìn)行定量分析；

色譜條件：選用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，流速0.1～0.5mL/min，以0.05％～0.2％甲酸-水溶液為流動相A，0.05％～0.2％甲酸-乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序為：0～5min，12％～15％B；5～10min，15％～30％B；10～15min，30％～35％B；15.1～28min，12％B；圖譜采集時間為15min；

質(zhì)譜條件：采用ESI正離子化模式，SRM-IDA-EPI掃描模式，根據(jù)在線優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行樣品測定；其質(zhì)譜檢測ESI正離子化模式源參數(shù)為：GS₁為55psi，GS₂為55psi；氣簾氣為30psi；碰撞氣為high；噴霧電壓4500V；離子化溫度550℃；射入電壓10V；碰撞室射出電壓13V；脫簇電壓為70V；其質(zhì)譜檢測SRM-IDA-EPI掃描模式為：IDA閾值為300cps，CE為40eV，CES為35eV。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法還包括：

內(nèi)標(biāo)溶液制備：取內(nèi)標(biāo)物比伐盧定配制8～12μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液；

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：取如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并稀釋得到系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中各多肽的濃度范圍為0.4～1250.00ng/mL，所述系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入等體積的內(nèi)標(biāo)溶液，得系列濃度梯度的含內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：其色譜條件為：選用HSS T3色譜柱；流速0.2mL/min，以0.1％甲酸-水溶液為流動相A，以0.1％甲酸-乙腈溶液為流動相B，圖譜采集時間為15min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：還包括對質(zhì)譜參數(shù)的在線優(yōu)化：以所述特征多肽的雙電荷準(zhǔn)分子離子為母離子，單電荷子離子碎片構(gòu)建三對離子對，進(jìn)而衍生產(chǎn)生三組偽離子對，每組偽離子對分別對應(yīng)在5～50eV范圍內(nèi)梯級變化的CE；不同碰撞能的偽離子對產(chǎn)生不同的相對響應(yīng)值，利用高斯曲線擬合構(gòu)建候選離子對的相對響應(yīng)值-碰撞能曲線，以該曲線的最高點對應(yīng)CE值作為最優(yōu)CE值。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述特征多肽的定量離子對及碰撞能CE如下表所示：

6.麝香中的特征多肽，所述特征多肽包括如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽。