[發(fā)明專利]一種植物乳桿菌的基因在葉酸生物生成中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110251431.5
• 申請(qǐng)日: 2021-03-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112961878B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳陳堅(jiān);趙志敏;李曉然
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/74
• 分類號(hào): C12N15/74;C12P17/18;C12N15/55;C12R1/25
• 代理公司: 北京中北知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11253
• 代理人: 楊亞潔

1.一種folQ基因在植物乳桿菌(L.plantarum)葉酸生物生成中的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用主要通過(guò)以下步驟：

(1)使用同源重組的方法，定向敲除植物乳桿菌野生型菌株YML4-3菌株葉酸合成DHPPP途徑中的folQ基因，得到folQ基因敲除菌株△fol?Q；

(2)仍使用同源重組方法將folQ基因回補(bǔ)至△folQ菌株中與野生型菌株YML4-3中folQ基因的相同位置，得到回補(bǔ)型菌株HBQ；

(3)測(cè)定三株菌生長(zhǎng)情況、抑制病原菌情況；

(4)使用qPCR方法測(cè)定YML4-3、△fol?Q和HBQ菌株葉酸合成途徑中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量；

(5)使用LC-MS測(cè)定三株菌不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生的葉酸含量，fol?Q基因主要影響單谷氨酸葉酸的合成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟(1)和步驟(2)中的同源重組方法中均使用溫度敏感型質(zhì)粒pFED760為骨架，構(gòu)建載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，其特征在于：所述步驟(1)中folQ基因進(jìn)行同源臂克隆后以質(zhì)粒pFED760為骨架構(gòu)建敲除載體，并將敲除載體轉(zhuǎn)化YML4-3菌株感受態(tài)細(xì)胞完成基因敲除。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述folQ基因進(jìn)行同源臂克隆的具體方法是先使用CTAB/酶法提取YML4-3基因組DNA，然后利用重疊PCR技術(shù)得到folQ基因上下游同源片段。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述以質(zhì)粒pFED760為骨架構(gòu)建敲除載體是使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，并使用酶切方法得到酶切產(chǎn)物，純化后連接目的片段和pFED760質(zhì)粒，并使用PCR法篩選重組菌株，獲得重組質(zhì)粒。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述敲除載體轉(zhuǎn)化YML4-3菌株感受態(tài)細(xì)胞完成基因敲除的具體步驟為：使用溫度敏感型質(zhì)粒pFED76進(jìn)行基因敲除，并將YML4-3菌株接種至培養(yǎng)基中制備感受態(tài)細(xì)胞，敲除載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并整合至YML4-3基因組中，最后敲除載體從基因組匯總脫離，完成基因敲除。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟(2)中敲除菌株fol?Q基因的回補(bǔ)中以野生型YML4-3菌株總DNA為模板，引物擴(kuò)增含有folQ基因及其上下游片段的目的序列。