[發明專利]誘發型炎癌轉化小鼠模型及其建立方法和應用

有效

• 申請號: 202110250008.3
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN113025650B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 詹林盛;呂麗萍;王小慧;張玉龍;曹相宜;周欠欠;馬平;孫蘇靜
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N15/54;A01K67/027
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

1.一種誘發型炎癌轉化小鼠模型的建立方法，其包括以下步驟：

1）將過表達外源性致癌基因的重組質粒、睡美人轉座酶表達質粒和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重組質粒共同溶解于生理鹽水中，獲得水動力基因轉染注射液；

2）以小于5秒的速度將步驟1）獲得的水動力基因轉染注射液注于小鼠尾靜脈中，隨后正常喂養小鼠，當所述外源性致癌基因在小鼠肝臟中過表達，以及所述目的抑癌基因在小鼠肝臟中的表達被敲低后，建立誘發型炎癌轉化小鼠模型；

所述睡美人轉座酶表達質粒為pCMV/SB，所述過表達外源性致癌基因的重組質粒為過表達c-met基因的重組質粒和過表達△N90-β-catenin基因的重組質粒，所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重組質粒為可敲除小鼠pten基因的重組質粒和可敲除小鼠p53基因的重組質粒；其中所述睡美人轉座酶表達質粒、過表達c-met基因的重組質粒、過表達△N90-β-catenin基因的重組質粒、可敲除小鼠pten基因的重組質粒和可敲除小鼠p53基因的重組質粒的使用量各為5 μg～10 μg，且所述睡美人轉座酶表達質粒、過表達c-met基因的重組質粒、過表達△N90-β-catenin基因的重組質粒、可敲除小鼠pten基因的重組質粒和可敲除小鼠p53基因的重組質粒的使用量之比滿足1:（1～2）:（1～2）:（1～2）:（1～2）；

在所述可敲除小鼠pten基因的重組質粒中，sgRNA的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示，在所述可敲除小鼠p53基因的重組質粒中，sgRNA的序列分別如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）的具體操作為：將所述睡美人轉座酶表達質粒、過表達外源性致癌基因的重組質粒、和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重組質粒溶解于相當于小鼠體重8%～12%的生理鹽水中。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1）的具體操作為：將所述睡美人轉座酶表達質粒5 μg以及過表達c-met基因的重組質粒、過表達△N90-β-catenin基因的重組質粒、可敲除小鼠pten基因的重組質粒和可敲除小鼠p53基因的重組質粒各10 μg溶解于相當于小鼠體重8%～12%的生理鹽水中。

4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，步驟2）中以小于5秒的速度將步驟1）獲得的水動力基因轉染注射液注于小鼠尾靜脈中6周后，建立獲得誘發型炎癌轉化小鼠模型。

5.一種用于水動力基因轉染獲得誘發型炎癌轉化小鼠模型的質粒組合，其由睡美人轉座酶表達質粒、過表達外源性致癌基因的重組質粒、和可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重組質粒組成；其中所述過表達外源性致癌基因的重組質粒為過表達c-met基因的重組質粒和過表達△N90-β-catenin基因的重組質粒；所述可敲除目的抑癌基因的CRISPR/Cas9重組質粒為可敲除小鼠pten基因的重組質粒和可敲除小鼠p53基因的重組質粒；所述睡美人轉座酶表達質粒為pCMV/SB；

在所述可敲除小鼠pten基因的重組質粒中，sgRNA的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示，在所述可敲除小鼠p53基因的重組質粒中，sgRNA的序列分別如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

其中在單次水動力基因轉染中，所述睡美人轉座酶表達質粒、過表達c-met基因的重組質粒、過表達△N90-β-catenin基因的重組質粒、可敲除小鼠pten基因的重組質粒和可敲除小鼠p53基因的重組質粒的使用量各為5 μg～10 μg，且所述睡美人轉座酶表達質粒、過表達c-met基因的重組質粒、過表達△N90-β-catenin基因的重組質粒、可敲除小鼠pten基因的重組質粒和可敲除小鼠p53基因的重組質粒的使用量之比滿足1:（1～2）:（1～2）:（1～2）:（1～2）。