[發(fā)明專利]一種單細(xì)胞測序篩選軟骨細(xì)胞標(biāo)記分子的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110249055.6
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN112852919A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于騰波;陳進(jìn)利;趙海波;趙夏;姜弘元;王天瑞;馬金龍;孫澤文;于承浩;李天予;韓增帥
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6811
• 分類號: C12Q1/6811
• 代理公司: 北京挺立專利事務(wù)所(普通合伙) 11265
• 代理人: 王莉

本發(fā)明公開了一種利用單細(xì)胞測序篩選軟骨細(xì)胞標(biāo)記分子的方法，包括以下步驟：(1)分離軟骨組織；(2)分離單細(xì)胞并進(jìn)行裂解；(3)對樣品的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；(4)以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，進(jìn)行Tagmentation反應(yīng)，完成cDNA測序文庫構(gòu)建；(5)對構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行高通量測序；(6)測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找軟骨細(xì)胞特異性的標(biāo)記分子。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用單細(xì)胞測序篩選軟骨細(xì)胞標(biāo)記分子的方法。

背景技術(shù)

骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨退化、軟骨下骨硬化，骨贅形成并伴有關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形及活動障礙的慢性退行性關(guān)節(jié)病，且多發(fā)于膝、髓等負(fù)重關(guān)節(jié)叫。據(jù)統(tǒng)計全世界骨關(guān)節(jié)炎患病率約為15％，其中50歲以上老年人群的發(fā)病率達(dá)到50％，最終致殘率高達(dá)53％。我國流行病調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)我國40歲以上人群膝、手、頸、腰關(guān)節(jié)炎的總患病率則高達(dá)46.3％。關(guān)節(jié)功能的喪失及致殘不僅嚴(yán)重影響老年人群的生活質(zhì)量還加重家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，有效預(yù)防該病已成為國內(nèi)外重大的公共衛(wèi)生問題。

骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病與衰老軟骨細(xì)胞的累積導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成降解平衡失調(diào)，關(guān)節(jié)軟骨組織的分解退變，關(guān)節(jié)內(nèi)持續(xù)病理性炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。臨床骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞常會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，且該現(xiàn)象隨著關(guān)節(jié)軟骨組織退變的嚴(yán)重程度越發(fā)明顯。軟骨細(xì)胞衰老在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，因此延緩或清除衰老軟骨細(xì)胞有可能抑制骨關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨組織的完整性，改善骨關(guān)節(jié)炎的病理變化，緩解骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛。

因此，若能不斷發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子及調(diào)控因子，從分子水平探討骨關(guān)節(jié)炎與軟骨細(xì)胞之間的相互作用，可為深刻揭示骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的機(jī)制提供更有效的科學(xué)依據(jù)，同時也能為臨床治療骨關(guān)節(jié)炎提供新思路和新方法。

我們利用單細(xì)胞測序技術(shù)在軟骨細(xì)胞的單細(xì)胞水平上對全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測序，在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的規(guī)律，最后利用生物信息學(xué)分析技術(shù)，從mRNA水平上分析尋找軟骨細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子，為骨關(guān)節(jié)炎的靶向治療提供新靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對上述存在的科學(xué)問題，提供一種單細(xì)胞測序篩選軟骨細(xì)胞標(biāo)記分子的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

本發(fā)明的單細(xì)胞測序篩選軟骨細(xì)胞標(biāo)記分子的方法，包括以下步驟：

1)提取軟骨組織；

2)分離單細(xì)胞并進(jìn)行裂解：分離單細(xì)胞，加入裂解緩沖液中進(jìn)行裂解，得到細(xì)胞裂解液；

3)對樣品的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA：使用美國ThermoFisher公司的SuperScript試劑盒構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄體系，對上述步驟2)獲得的細(xì)胞裂解液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

4)以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建測序文庫，進(jìn)行測序：使用美國Illumina公司的NexteraXT試劑盒，按照說明書對上述步驟3)得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增和純化，構(gòu)建高通量測序文庫；完成后將文庫送交測序；

5)對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從mRNA水平上分析尋找軟骨細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子。

以上所述步驟1)中，將從軟骨組織中提取的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序，利用生物信息學(xué)分析從mRNA水平上尋找其特異的標(biāo)記分子。

本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是：

通過利用單細(xì)胞測序技術(shù)，將從軟骨組織中提取的軟骨細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序，利用生物信息學(xué)分析從mRNA水平上尋找其特異的標(biāo)記分子，為靶向治療尋找新的靶點(diǎn)提供更為全面、客觀、準(zhǔn)確的方法。

附圖說明

圖1為單細(xì)胞測序檢測軟骨組織中細(xì)胞亞群。