[發明專利]一種可用于雙模態成像的腺相關病毒及其應用

在審

• 申請號: 202110248492.6
• 申請日: 2021-03-05
• 公開（公告）號: CN113025657A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 鄭寧;李梅;吳陽;王杰;徐富強
• 申請（專利權）人: 中國科學院精密測量科學與技術創新研究院
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N7/01;C12N15/62;C12N15/65;A61K49/00;A61K49/18
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 江麗麗

本發明公開了一種可用于雙模態成像的腺相關病毒及其應用。在AAV載體質粒的ITR中間依次插入CAG啟動子、AQP1基因、2A連接序列、EGFP基因、WPRE轉錄后調控元件以及polyA序列。將制備的重組腺相關病毒感染動物活體神經細胞后，可在神經細胞內介導AQP1與EGFP蛋白的表達，從而使表達區域具有綠色熒光信號，同時可導致擴散加權MRI信號改變，從而具有雙模態成像的特征。本發明公開的病毒載體轉導的外源基因的表達水平可通過無創的磁共振成像在活體組織原位觀察，也可通過熒光成像在離體組織中觀察，可用于磁共振成像造影、神經元標記、神經環路示蹤等。

技術領域

本發明屬于病毒載體技術領域，具體涉及一種攜帶1型水通道蛋白與綠色熒光蛋白融合基因的腺相關病毒及其應用。

背景技術

通過非侵入性的成像方法檢測活體動物內基因的表達對于基因轉導、基因治療、細胞移植、細胞治療等領域非常關鍵，另外活體內檢測基因表達的方法將有助于基礎的生物學研究。在進行基因轉導或細胞移植時，通常會使用一種報告基因來標記目標基因或感興趣基因的表達。目前，最常用的報告基因是基于熒光蛋白與化學發光蛋白的基因。由于光線難以穿透深層組織，光學成像很難在活體水平獲得不透明的深部組織的基因表達結果，因此，現有的研究中，大部分基因的表達是通過離體的光學成像顯示，如使用綠色熒光蛋白EGFP基因作為報告基因，使用熒光成像觀察基因表達結果。離體的光學圖像可以達到良好的空間分辨率和靈敏度，但其結果無法顯示基因表達在活體內的水平，也無法實現對同一個實驗對象進行多次觀測的長時程實驗。

磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)是一種綜合了非侵入性、無電離輻射、高穿透性、適用于軟組織等多種優勢的成像方法，已被廣泛運用于臨床診斷與科學研究。并且對于人體以及目前常用的哺乳類模式動物(大小鼠)MRI可實現較高的時空分辨率。因此，已有大量的研究著力于構建或定義基于磁共振成像的報告基因。目前，基于磁共振成像造影的報告基因主要分為兩大類。一類是基于金屬蛋白和金屬離子轉運蛋白，它們主要通過富集順磁性的金屬離子來增強弛豫，從而導致T1或T2加權信號的變化。另一類是基于化學交換飽和轉移，通過可交換的質子以及化學交換飽和轉移的原理來產生MRI對比。其中第一類報告基因的局限是金屬離子的生物可用度，以及金屬離子的毒性。第二類的報告基因的局限是檢測靈敏度偏低，需要大量表達(2.5μM)才能產生可觀測的造影效果。

近年來，有文獻報道水通道蛋白(Aquaporin,AQP)基因也可作為磁共振成像報告基因，過表達AQP1蛋白可產生DWI-MRI信號的改變，并且不會對細胞或組織造成明顯的傷害。彌散加權成像(Diffusion-weighted imaging，DWI)是廣泛應用的成熟MRI技術，在基礎的生物生理學研究和疾病的診斷中具有應用。DWI通常是通過施加一對梯度磁場以使擴散的水分子中自旋散相，從而產生擴散加權對比度。水通道蛋白是一組高度保守的跨膜轉運蛋白，以四聚體的形式富集于細胞膜，它表達于多種類型的細胞中，對水具有高度選擇通透性。根據文獻報道，過表達1型水通道蛋白(AQP1)可促進水的跨膜擴散，從而增強DWI MRI的對比度，在DWI-MRI圖像上呈現暗信號，而在表觀擴散系數ADC map上呈現高信號。作為MRI報告基因，AQP1的靈敏度較高(500nM)，并且不依賴于金屬離子，從而規避了前述兩類報告基因的缺陷。

目前，尚沒有直接利用病毒載體攜帶AQP1基因用于活體動物水平MRI成像造影的報道。病毒作為基因載體可介導外源基因在多種類型的細胞中表達，可通過分子元件限制外源基因在特異類型細胞中表達，并可能通過藥物控制外源基因在特定時間段內表達(條件性表達)。在眾多類型的病毒載體中，重組腺相關病毒載體(rAAV)具有、毒性低、免疫原性低、感染宿主范圍廣、攜帶外源基因表達穩定持久等優勢，因此已被廣泛應用于神經環路示蹤以及基因治療中。根據本實驗室前期探索的結果，相較于常用的嗜神經病毒載體單純皰疹病毒HSV、水泡型口炎病毒VSV，rAAV載體可在動物體內表達時間更長，從而更高的表達量。并且AAV包裝周期短，能更快地獲得純化的病毒用于活體實驗。