[發明專利]一種通過共轉飛燕草苷合成相關基因培育藍色菊花的方法

有效

• 申請號: 202110246774.2
• 申請日: 2021-03-05
• 公開（公告）號: CN113278648B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 蔣甲福;祝欽瀧;林嬌陽;韓笑盈;羅宇婷;吳慧瑩;周李杰;陳素梅;房偉民;陳發棣
• 申請（專利權）人: 南京農業大學;華南農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;A01H5/02;A01H6/14
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.飛燕草DgAA7GT、DgSCPL2和DgAA7BG-GT1基因在培育藍色菊花中的應用，其特征在于：為將所述飛燕草DgAA7GT、DgSCPL2和DgAA7BG-GT1、及風鈴草Cam?F3'5'H和蝶豆花CtA3'5'GT基因的共表達載體導入切花菊，進行特異表達以培育藍色菊花。

2.?根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述的飛燕草DgAA7GT、DgSCPL2和DgAA7BG-GT1、及風鈴草Cam?F3'5'H和蝶豆花CtA3'5'GT基因的共表達載體采用以下步驟制備：

在GenBank登錄號為?FW570860.1的菊花基因F3H的啟動子序列的?3’端加上如SEQ?IDNO.?1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，將該基因片段分別插入到GenBank登錄號為KY420076.1的pYL322d1和GenBank登錄號為KY420077.1的pYL322d2載體的Xho?I和Pst?I酶切位點，分別得到d1F3HP和d2F3HP載體；

在GenBank登錄號為AB115560.1的蝶豆花CtA3’5’GT基因序列的終止密碼子后加上如SEQ?ID?NO.?2所示的35S?PolyA終止子序列，然后插入到所述d2F3HP載體的Kpn?I和Sma?I位點，得到d2F3HPCtA3’5’GT載體；

將GenBank登錄號為D14590.1的風鈴草CamF3’5’H基因序列加上如SEQ?ID?NO.?3所示的Nos終止子序列，然后插入到所述d1F3HP載體的?Kpn?I和Sma?I位點，得到d1F3HP?CamF3’5’H載體；

在由如SEQ?ID?NO.6所示的章魚堿合成酶基因啟動子中增強子序列和如SEQ?ID?NO.7所示的月季花瓣特異表達的查爾酮合成酶基因啟動子片段RCHS拼接后形成的月季花特異嵌合啟動子pOCSenhancer-RCHS的3’端加上如SEQ?ID?NO.?1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的啟動子片段，將該啟動子片段插入到GenBank登錄號為?KY420076.1的pYL322d1載體的Pst?I和Nco?I酶切位點，得到d1?RCHSA載體；將GenBank登錄號為AB510758的飛燕草DgAA7GT?基因的3’端加上如SEQ?ID?NO.?3所示的Nos終止子序列，然后插入到所述d1RCHSA載體的Nco?I和Xma?I酶切位點，得到d1?RCHSADg7GT載體；

使用上游引物SEQ?ID?NO.8和下游引物SEQ?ID?NO.9對所述的d2F3HPCtA3’5’GT載體中的Ct3’5’GT基因表達盒進行PCR擴增，回收目的片段，設為片段A；使用內切酶Asc?I切割所述的d1?RCHSADg7GT載體，將載體線性化，將滅活的酶切混合液置于透析膜上，以1/3?TE緩沖液為透析液，根據離子濃度差進行單向滲透，去除混合液中的鹽離子等雜質，設為片段B；將片段A與片段B進行Gibson組裝后將反應混合液置于透析膜上放置，取透析后的反應混合液電擊轉化大腸桿菌DH10B，篩選陽性單克隆菌斑并測序驗證，從而獲得同時含有兩個表達盒的新載體322d1-7GT-Ct3’5’GT；

在GenBank登錄號為AB763911.1的菊花啟動子CmCCD4a-5?promoter的5’端加上如SEQID?NO.6所示的章魚堿合成酶基因啟動子中增強子序列得到新的基因片段，將該基因片段插入到GenBank登錄號為KY420077.1的pYL322d2載體的Pst?I和Nco?I酶切位點，得到d2CCD4P載體；將GenBank登錄號為AB811449的飛燕草DgSCPL2?的3’端加上如SEQ?ID?NO.?2所示的35S?PolyA終止子序列，然后插入到所述d2CCD4P載體的Xma?I和?Sal?I?酶切位點，得到d2CCD4PDgSCPL2載體；

在GenBank登錄號為AB232773.1的牽牛花啟動子InMYB1P的3’端加上如SEQ?ID?NO.?1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，將該基因片段插入到GenBank登錄號為KY420076.1的pYL322d1載體的Pst?I和Nco?I酶切位點，得到d1MYB1P載體；將GenBank登錄號為AB811444的飛燕草DgAA7BG-GT1的3’端加上如SEQ?ID?NO.?3所示的Nos終止子序列，然后插入到所述d1MYB1P載體的Xma?I和?Sal?I酶切位點，得到d1MYB1P?Dg7BG-GT1載體；

使用上游引物SEQ?ID?NO.10和下游引物SEQ?ID?NO.11對載體d1MYB1P?Dg7BG-GT1中的Dg7BG-GT1基因表達盒進行PCR擴增，回收目的片段，設為片段C，使用內切酶Asc?I切割d2CCD4PDgSCPL2載體，將載體線性化，將滅活的酶切混合液置于透析膜上放置，回收透析后的反應混合液，設為片段D；將片段D與片段C進行Gibson組裝后將反應混合液置于透析膜上放置，取透析后的反應混合液電擊轉化大腸桿菌DH10B，篩選陽性單克隆菌斑并測序驗證，從而獲得同時含有兩個表達盒的新載體322d2-7BG-SCPL2；

將Genebank登錄號為KY420082.1的空載體pYLTAC380N稱為380N，將等量的空載體380N和上述載體322d1-7GT-Ct3’5’GT混合均勻后電擊轉化NS3529感受態菌株中，NS3529菌株內表達的細菌噬菌體P1的I型拓撲異構酶能在loxP位點的作用下進行片段間置換，將7GT-Ct3’5’GT雙表達盒整合到380N載體上，電擊轉化后在卡納霉素Kan+氯霉素Chl雙抗平板上培養，收集平板上所有菌落進行質粒提取，獲得質?；斐橐海撡|?；斐橐后w系為質粒間進行片段置換各種時期質粒共存的混合體，使用歸巢酶I-Sce?I將未完成置換的載體線性化，僅保留已完成反應的環狀載體，將混合液置于透析膜上放置后，取透析后的反應混合液電擊轉化大腸桿菌DH10B，篩選陽性單克隆菌斑并測序驗證，從而獲得同時含有兩個表達盒的新載體380N-7GT-Ct3’5’GT；

將等量的載體380N-7GT-Ct3’5’GT和載體322d2-7BG-SCPL2混合均勻后電擊轉化NS3529感受態菌株中，NS3529菌株內表達的細菌噬菌體P1的I型拓撲異構酶能在loxP位點的作用下進行片段間置換，將7BG-SCPL2雙表達盒整合到380N-7GT-Ct3’5’GT載體上；電擊轉化后在卡納霉素Kan+氨芐青霉素Amp雙抗平板上培養，收集平板上所有菌落進行質粒提取，獲得質?；斐橐?，該質粒混抽液體系為質粒間進行片段置換各時期共存的混合體，使用歸巢酶PI-Sce?I將未完成置換的載體線性化，僅保留已完成反應的環狀載體，將混合液置于透析膜上放置后，取透析后的反應混合液電擊轉化大腸桿菌DH10B，篩選陽性單克隆菌斑，從而獲得同時含有四個表達盒的新載體380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT；

重復上述步驟，將上述載體d1F3HPCamF3’5’H與載體380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT混勻后電擊轉化NS3529感受態菌株，將CamF3’5’H表達盒整合到載體380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT上，從而獲得新載體380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT。