[發(fā)明專利]一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中脂溶性維生素的樣品前處理方法

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• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN113390975A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾珊珊;張琦;王媛;韓寶玉;劉鵬云;劉華芬
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州凱萊譜精準(zhǔn)醫(yī)療檢測技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧;曹小燕

本發(fā)明提供了一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中脂溶性維生素的樣品前處理方法，通過采用特定的蛋白沉淀劑，并與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品工作液混合成內(nèi)標(biāo)溶液，從而簡單高效地完成樣品前處理，無需任何額外的樣品富集等操作，即可顯著提高血清樣品中脂溶性維生素A、E、K1、K2的回收率，降低樣品前處理的成本，從而大幅提升血清中脂溶性維生素檢測的靈敏度，并能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。同時本發(fā)明還提供了乙酸銨用于制備蛋白沉淀劑的用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中脂溶性維生素的樣品前處理方法。

背景技術(shù)

維生素A(VA)又稱視黃醇，具有維持正常視覺、維護(hù)上皮組織、促進(jìn)骨骼正常生長發(fā)育的功能。人體內(nèi)VA不足會導(dǎo)致干眼病、夜盲癥和皮膚過度角化等營養(yǎng)缺乏癥。25-羥基維生素D是調(diào)節(jié)人體鈣磷代謝的重要因子，協(xié)調(diào)骨鈣的動員或沉積、尿鈣的吸收或排泄，維持體內(nèi)血鈣水平的穩(wěn)定，對骨骼發(fā)育塑形、肌肉神經(jīng)傳導(dǎo)效應(yīng)及細(xì)胞活動、信息傳遞等生命活動至關(guān)重要。兒童缺乏表現(xiàn)為佝僂病，成人缺乏表現(xiàn)為骨軟化、骨質(zhì)疏松；過量會引起鈣的吸收增加，導(dǎo)致高鈣血癥。維生素E(VE)是一組以立體異構(gòu)體存在的生育酚類物質(zhì)，其中以α-生育酚活性最強(qiáng)。VE能促進(jìn)性激素分泌，提高男性和女性的生育能力，能防止自由基或氧化劑對細(xì)胞膜的損傷，具有預(yù)防動脈粥樣硬化、心血管系統(tǒng)疾病和更年期綜合癥的生理作用，VE缺乏時會出現(xiàn)睪丸萎縮和上皮細(xì)胞變性，致孕育異常。維生素K主要的生理作用是參與凝血酶原及凝血因子的合成，人體缺乏VK會導(dǎo)致凝血時間延長，嚴(yán)重者有出血傾向，在某些因素的影響下(如感染、腹瀉等)甚至有顱內(nèi)出血的風(fēng)險，其中維生素K1是肝臟合成因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ所必須的物質(zhì)，在臨床上應(yīng)用于凝血酶過低癥、維生素K1缺乏癥、新生兒自然出血癥的防治以及梗阻性黃疸、膽瘺、慢性腹瀉等所致出血，香豆素類、水楊酸鈉等所致的低凝血酶原血癥；維生素K2是維生素K唯一具有生物活性的形式，多用于加速凝血、維持凝血時間、治療維生素K缺乏引起的出血癥，也有用于其他保健途徑的報道。因此，脂溶性維生素的檢測可評估患者體內(nèi)的脂溶性維生素的營養(yǎng)狀況。對脂溶性維生素缺乏或過量的臨床判斷、治療管理和生理評估具有輔助診斷的意義。

現(xiàn)有的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中脂溶性維生素的樣品前處理方法主要是采用液液提取(如CN106504947A)和固液萃取方法(如CN110763788A)，需經(jīng)稀釋、多次萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮?dú)獯蹈伞艋榷鄠€步驟，過程繁瑣，需大量的人工操作，而且液液提取難以實(shí)現(xiàn)高通量和自動化，固液萃取雖然能實(shí)現(xiàn)高通量，但其中樣品萃取過程主要依靠SLE板來完成，耗材成本高。

目前也有不少采用蛋白沉淀法進(jìn)行血清和血漿中脂溶性維生素樣品測定的樣品前處理的相關(guān)專利申請，如CN111999397A、CN110487943B等，但普遍存在回收率不高而導(dǎo)致靈敏度偏低的問題，有些甚至在蛋白沉淀后，還需要進(jìn)一步萃取，才能進(jìn)行后續(xù)的檢測分析，使臨床檢測需要更多的人工操作，不利于臨床的推廣和使用。

因此迫切需要一種操作簡單、處理效率高、回收率高、成本低、人工工作量小等優(yōu)點(diǎn)的脂溶性維生素樣品前處理方法，使其可以克服現(xiàn)有方法的以上不足和缺陷，從而使高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中脂溶性維生素的方法具備更高的靈敏度，檢測過程更加簡便高效，并能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中脂溶性維生素的樣品前處理方法，通過采用特定的蛋白沉淀劑，并與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品工作液混合成內(nèi)標(biāo)溶液，從而簡單高效地完成樣品前處理，無需任何額外的樣品富集等操作，即可顯著提高血清樣品中脂溶性維生素的回收率，降低樣品前處理的成本，從而大幅提升血清中脂溶性維生素檢測的靈敏度，并能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

一方面，本發(fā)明提供了一種用于血清中脂溶性維生素提取的蛋白沉淀劑，包括甲醇、乙腈和異丙醇。