[發(fā)明專利]一種親和切向流過濾系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和外泌體提取方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110240790.0
• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN113101737B
• 公開（公告）日: 2023-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張海心
• 申請（專利權(quán)）人: 京美生命科技（杭州）有限公司
• 主分類號: B01D36/00
• 分類號: B01D36/00
• 代理公司: 北京華清迪源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11577
• 代理人: 丁彥峰

本發(fā)明公開了一種親和切向流過濾系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和外泌體提取方法及應(yīng)用。所述提取方法包括：將所述含外泌體的樣本溶液與親和液充分混合置于第一儲存罐中，打開開關(guān)K2，斷開開關(guān)K1、K3，開啟第一蠕動泵，流經(jīng)Reprotidesupgt;TM/supgt;511蛋白交聯(lián)納米親和微球柱，循環(huán)流動；對Reprotidesupgt;TM/supgt;511蛋白交聯(lián)納米親和微球柱進(jìn)行洗滌、洗脫后；打開開關(guān)K1，關(guān)閉開關(guān)K3、K2，將溶液泵入第二儲存罐中，打開第二蠕動泵，讓溶液經(jīng)過濾裝置，循環(huán)濃縮過濾至最小運(yùn)行體積；加入無菌PBS緩沖液，循環(huán)濃縮過濾，即得提取純化的外泌體溶液。本發(fā)明可用于大體積復(fù)雜樣本外泌體提取制備，操作方便，提取效率高，外泌體純度高，產(chǎn)量多，生物學(xué)活性高，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本外泌體的批量自動化提取，具有極大的商業(yè)價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種親和切向流過濾系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和外泌體提取方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

外泌體是有活細(xì)胞分泌的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的小囊泡，直徑在30-150nm，可存在于各種體液中，如血清、血漿、唾液、尿液，腹水、脊髓液、乳汁等。外泌體中含有多種生物分子，如mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，可以傳遞給受體細(xì)胞，從而改變受體細(xì)胞的生理功能或病理功能。近幾年，外泌體作為細(xì)胞間的信息傳遞工具及各種疾病的生物標(biāo)志物而引起廣泛的關(guān)注，外泌體具有在生物醫(yī)藥及疾病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)潛力。

針對外泌體的提取純化沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，常用的方法有很多種，超速離心法、密度梯度離心法，超濾法，聚合物沉淀法，免疫捕獲法等。超速離心法雖然是公認(rèn)的外泌體提取的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，但是操作費(fèi)時費(fèi)力、高度依賴人工，回收率低，外泌體形態(tài)大小不一，高速離心會損害外泌體而影響下游實(shí)驗(yàn)。密度梯度離心法雖然可以獲得很純的外泌體，但該方法操作繁瑣，重復(fù)性差，耗時很長，回收率低，不適合大批量提取外泌體。超濾法可以方便快速的提取外泌體，但該方法提取的外泌體中含有大顆粒雜質(zhì)污染，嚴(yán)重影響下游應(yīng)用。聚合物沉淀法提取的外泌體中雜蛋白污染多，顆粒形態(tài)不均一，影響下游分析。免疫捕獲法雖然可以特異性地捕獲外泌體，獲得的外泌體純度高，但該方法成本高且產(chǎn)量低，不能提取樣本中所有的外泌體，只能提取某種表面抗原陽性的外泌體。但是，血清，血漿，牛奶等成分復(fù)雜的樣本，由于溶液中含有大量的顆粒物質(zhì)，如載脂蛋白，脂顆粒等，可對外泌體造成嚴(yán)重污染，而目前的眾多方法中，還沒有針對此類樣品的外泌體批量提取方法。

綜上所述，急需一種操作方便，提取效率高，獲得的外泌體純度高，可以適合大體積復(fù)雜樣本的外泌體提取純化方法。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明提供一種親和切向流過濾系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和外泌體提取方法及應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中操作復(fù)雜、提取效率低、樣本量小、提取的外泌體純度低、重復(fù)性差等問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的第一方面提供的一種用于外泌體提取的親和切向流過濾系統(tǒng)，所述過濾系統(tǒng)包括：第一儲存罐、第二儲存罐、Reprotide^TM511蛋白交聯(lián)納米親和微球柱、過濾裝置、第一蠕動泵、第二蠕動泵和三個開關(guān)K1、K2、K3；

其中，第一儲存罐的出口經(jīng)第一蠕動泵與Reprotide^TM511蛋白交聯(lián)納米親和微球柱的入口連接，Reprotide^TM511蛋白交聯(lián)納米親和微球柱的出口分別通過開關(guān)K1、K2、K3的開閉來控制柱內(nèi)的液體流向，其中開關(guān)K1、K2關(guān)閉時，開開關(guān)K3，液體流出體系，開關(guān)K1、K3關(guān)閉時，開開關(guān)K2，液體循環(huán)流回第一儲存罐，開關(guān)K2、K3關(guān)閉時，開開關(guān)K1，液體經(jīng)第二儲存罐的入口進(jìn)入第二儲存罐；第二儲存罐的出口經(jīng)第二蠕動泵與過濾裝置的入口連接，過濾裝置的出口與第二儲存罐的第二入口連接，經(jīng)過濾裝置過濾后的液體直接流出體系；

其中，所述過濾裝置是設(shè)有切向流過濾膜F的過濾體系，所述切向流過濾膜F的截留分子量為50-750kD。