[發(fā)明專利]一種高純度ssDNA制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110236225.7
• 申請日: 2021-03-03
• 公開（公告）號: CN112877325A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 雍金貴;崔康樂;王維坤;駱曉雯;張慶
• 申請（專利權(quán)）人: 通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34160
• 代理人: 劉生昕

1.一種高純度ssDNA制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

第一步：合成所需目的基因到puc57載體中；

第二步：磷酸化雙鏈DNA的合成；

第三步：lambda核酸外切酶消化磷酸化雙鏈DNA，得到ssDNA；

第四步：通過雙鏈特異性酶去除殘留雙鏈DNA，得到高純度的ssDNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度ssDNA制備方法，其特征在于，合成所需目的基因到puc57載體中具體包括以下步驟:

第一步：根據(jù)需要ssDNA序列，通過重疊pcr的原理擴增得到所需DNA序列，得到pcr產(chǎn)物；

第二步：將puc57載體質(zhì)粒通過ECORV酶使載體線性化，將pcr產(chǎn)物與線性化載體連接，得到重組產(chǎn)物；

第三步：將重組產(chǎn)物取9-11ul轉(zhuǎn)移到T1感受態(tài)細胞中，置于冰上8-12min，然后40-44℃熱激85-95s，再置于冰上1-5min，加入550-650ulLB培養(yǎng)基，35-39℃，210-230rpm條件下培養(yǎng)38-42min，取90-110ul涂平板，最后37℃過夜培養(yǎng)；

第四步：第二天，利用菌落pcr方法篩選陽性克隆，并利用Sanger法測序驗證目的序列完全正確，得到正確克隆。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度ssDNA制備方法，其特征在于，磷酸化雙鏈DNA的合成具體包括以下步驟：

S1：合成尾引物為磷酸化引物，首引物為普通引物，pcr擴增目的基因；

PCR體系如下：工作液90-94ul、引物F1-3ul、磷酸化引物R1-3ul、模板0.4-0.6ul、A酶1-3ul；PCR程序如下：先于98℃保持10S進行變性，然后將溫度降至58℃保持25S進行退火，再在72℃保持30S進行延伸，合成磷酸化雙鏈DNA，完成一組循環(huán)，重復(fù)循環(huán)30次，在溫度72℃保持2min，最后在4℃保存；

S2、瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶是否單一清晰，與目的基因大小一致，利用PCRA回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物，否則棄用；回收產(chǎn)物用去核酸酶水洗脫，濃度應(yīng)在100-200ng/ul。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度ssDNA制備方法，其特征在于，利用lambda核酸外切酶消化磷酸化雙鏈DNA，得到ssDNA；反應(yīng)體系如下：10×buffer1-3ul、DsDNA1-2ug、Lambda酶1-1.5ul、NFH₂O14.5-15ul；反應(yīng)條件如下：37℃5min，80℃5min，4℃1min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度ssDNA制備方法，其特征在于，通過雙鏈特異性酶去除殘留雙鏈DNA的反應(yīng)體系為ssDNA產(chǎn)物16-18ul、10×dsDNaseBuffer1-3ul、dsDNase0.8-1.2ul；反應(yīng)條件如下：37℃5min，80℃5min；酶切后的ssDNA通過異丙醇沉淀的方法得到無雙鏈殘留、高純度的ssDNA；再利用s1酶驗證dsDNA是否消化完全。