[發明專利]草莓炭疽病菌C·siamense特異性PCR檢測引物及其檢測方法與應用

在審

• 申請號: 202110235149.8
• 申請日: 2021-03-03
• 公開（公告）號: CN112941222A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 唐冬蘭;曹榮祥;蔣立奔;唐泉;韓金龍;童曉利;孫永平;朱儆元
• 申請（專利權）人: 江蘇丘陵地區南京農業科學研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 陸志斌

1.草莓炭疽病菌C·siamense特異性PCR檢測用引物，其特征在于：引物序列為：

上游引物CgInt：5’-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3’

下游引物Cg478R：5’-TTTACGGCAAGAGTCCCTCC-3’

對草莓炭疽病菌C·siamense特異性擴增出389 bp的產物。

2.一種草莓C·siamense檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）從感染C·siamense的草莓組織中提取DNA；

（2）以步驟（1）提取的DNA為模板，利用CgInt/Cg478R這一對引物進行PCR擴增，第一輪取步驟（1）提取的DNA原液做模板進行單重PCR擴增，第二輪取第一輪PCR產物作為PCR反應模板進行PCR擴增；

（3）取3 μL步驟（2）的PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠進行電泳分離，電壓為70-100 V，然后于紫外燈下觀察，根據擴增產物的有無及其片段大小對結果進行判斷，如果能特異性地擴增出389 bp的條帶，即可判斷檢測草莓樣品中存在C·siamense。

3.根據權利要求2所述的一種草莓C·siamense檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）從感染C·siamense的草莓組織中提取DNA；

（2）以步驟（1）提取的DNA為模板，利用CgInt/Cg478R這一對引物進行PCR擴增，第一輪取4.9 μl提取的DNA原液做模板進行單重PCR擴增，第二輪取0.5 μL的第一輪PCR產物作為PCR反應模板進行PCR擴增；PCR反應體系為：反應總體積10 μL，包括，引物CgInt/Cg478R各0.25 μM，DNA模板，Es Taq MasterMix 5 μL，不足部分用無菌超純水補足；擴增程序為96^oC預變性5 min；96^oC變性30 s，50^oC退火45 s，72^oC延伸1 min，共30個循環；最后72^oC延伸7min；

（3）取3 μL步驟（2）的PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，電壓為70-100 V，40min后于紫外燈下觀察，根據擴增產物的有無及其片段大小對結果進行判斷，如果能特異性地擴增出389 bp的條帶，即可判斷所述的檢測樣品中存在C·siamense。

4.權利要求1所述的引物在作為田間草莓炭疽病的早期診斷和病菌的檢測及鑒定試劑中的應用。