[發明專利]高效檢測融合蛋白/抗體Fc段不能介導ADCC和CDC活性的方法

在審

• 申請號: 202110233928.4
• 申請日: 2021-03-03
• 公開（公告）號: CN112980851A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 肖志華;伍小春
• 申請（專利權）人: 上海奧浦邁生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;田歡

本發明屬于生物領域，具體涉及一種高效檢測融合蛋白或者抗體Fc段不能介導產生ADCC和CDC活性的方法。首先公開了一種檢測方法，所述檢測方法能夠快速找到能介導ADCC和CDC效應的陽性抗體和陽性細胞，且能夠直接驗證目標蛋白或者抗體的Fc序列不能或者只能微弱介導產生ADCC和CDC效應，所述方法包括：S1、載體的構建：根據Rituximab和IgG4的Fc序列進行密碼子優化，合成目的基因并插入質粒中，構建瞬轉表達載體；S2、質粒抽提和測序；S3、蛋白瞬時表達；S4、蛋白純化；S5、ADCC和CDC活性分析。本發明公開的檢測方法也能直接驗證目標蛋白或者抗體的Fc段不能或者只能微弱介導產生ADCC和CDC效應；檢測方法可靠、適用性廣且高效。

技術領域

本發明屬于生物領域，具體涉及一種高效檢測融合蛋白/抗體Fc段不能介導ADCC和CDC活性的方法。

技術背景

Fc融合蛋白或者抗體一般通過人的Fc段的FcRn(新生的Fc受體)介導的循環提高目標蛋白藥物的半衰期，改善藥代動力學特征，作用機制不依賴于ADCC/CDC活性。一些非癌適應癥抗體藥物，以及腫瘤免疫療法抗體藥物如PD-1/PD-L1抗體，其作用機制同樣不依賴于ADCC(抗體依賴性細胞毒性)、CDC(補體依賴性細胞毒性)活性。這時人的Fc段的細胞毒性作用ADCC、CDC可能帶來不必要的副作用。

目前，一些新上市的抗體藥物和在研的抗體/融合蛋白藥物，正在通過采用IgG2、IgG4亞型或者改造Fc(減弱或者去除ADCC/CDC效應)以得到更好的安全性和穩定性。

目前一些藥企證明Fc段不具備或者具有微弱介導ADCC、CDC活性的方案：

一、陽性對照：1)對于Fc突變的抗體或者蛋白要證明其Fc段不能或者只能微弱介導ADCC/CDC效應，其陽性對照為Fc未突變的相同靶點的抗體或者融合蛋白；2)而對于亞型為IgG2或者IgG4的抗體其陽性對照為具有相同靶點亞型為IgG1的抗體。陽性細胞：高表達該靶點的細胞。

缺陷和不足：1)陽性抗體即使在ELISA層面能和Fc受體或者C1q結合，但是不一定能介導效應細胞對高表達此靶點的細胞的ADCC和CDC作用；2)該靶點的陽性對照即使能介導ADCC作用，由于腫瘤細胞在其細胞表面經常高表達一些補體抑制劑如CD46，CD55和CD59，這些分子能夠保護靶細胞免受補體的殺傷作用，導致陽性抗體只具有非常弱或者基本沒有CDC作用。

陽性對照：已經上市的抗體或者融合蛋白，此抗體或者融合蛋白的靶點(此靶點不同于目標樣品的靶點)在所選的陽性靶細胞中也是高表達的；陽性細胞：同時高表達目標靶點和陽性抗體對應靶點的靶細胞。

缺陷和不足：1)同時高表達兩種靶點的靶細胞比較難找；2)兩個不同的靶點結合不同的靶位，目標抗體和陽性抗體Fc段也不同，在進行ADCC和CDC檢測時，即使陽性抗體顯示陽性結果，目標抗體顯示陰性結果，不能證明是Fab段還是Fc段導致的陰性結果；3)陽性抗體即使在ELISA層面能和Fc受體或者C1q結合，但是有些抗體不能在細胞層面介導ADCC和CDC作用；4)陽性對照即使能介導ADCC作用，由于腫瘤細胞在其細胞表面經常高表達一些補體抑制劑如CD46，CD55和CD59，這些分子能夠保護靶細胞免受補體介導的殺傷作用，導致陽性抗體只具有非常弱或者基本沒有CDC作用。

發明內容

為了解決上述的現有技術問題，本發明的技術方案把目標蛋白或者抗體的Fc嫁接到已知的抗體上(例如Rituximab)，陽性細胞選用高表達CD20的Raji細胞。陽性抗體即CD20的抗體Rituximab能介導Raji細胞很強的ADCC和CDC效應。本發明公開的檢測方法具有陽性抗體，陽性細胞好找，而且陽性抗體確定具有ADCC和CDC效果的優點，同時也能直接驗證目標蛋白或者抗體的Fc不能或者只能微弱介導產生ADCC和CDC效應。此方案適用于驗證所有Fc段不能或者只能微弱介導產生ADCC和CDC效應。

具體的，本發明的技術方案如下：