[發明專利]一種基于鎖核酸修飾的RMA法檢測ALDH2基因多態性的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202110229074.2
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN112852952A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 陳大為;陳龍;張瑤
• 申請（專利權）人: 濟南國益生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 濟南信在專利代理事務所(特殊普通合伙) 37271
• 代理人: 殷盛江

本申請屬于生物檢測技術領域，具體為一種基于鎖核酸修飾的RMA法檢測ALDH2基因多態性的試劑盒及檢測方法，所述引物探針組包括檢測ALDH2*2的引物、野生型探針和突變型探針；所述試劑盒，包括含有擴增反應試劑的檢測管、緩沖液、醋酸鎂、陽性對照、陰性對照；所述擴增反應試劑包括ALDH2*2上下游引物、ALDH2*2野生型和突變型探針、大腸桿菌RecA蛋白、UvsY蛋白、單鏈結合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚環氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

技術領域

本申請屬于生物檢測技術領域，具體為一種基于鎖核酸修飾的RMA法檢測ALDH2基因多態性的試劑盒及檢測方法。

背景技術

人乙醛脫氫酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是乙醛脫氫酶的1個亞類，可催化乙醛氧化為乙酸。ALDH2與亞洲人群最為密切的是ALDH2*2突變(rs671，1510GA)，突變率高達30％～50％。攜帶ALDH2*2突變基因的個體ALDH2酶活性下降，其中ALDH2*1/*2個體的酶活性僅為ALDH2*1/*1個體的10％，而ALDH2*2/*2個體的酶活性完全缺失。

ALDH2基因與酒精在人體內的分解代謝有關，還參與硝酸甘油的代謝。研究顯示ALDH2基因型可影響飲酒者對乙醇的敏感性和耐受性，突變型基因ALDH2*2能導致ALDH2活力的嚴重缺失，并與過度飲酒導致的酒精依賴、酒精性中毒、酒精性肝病、消化道癌癥等疾病之間存在深刻的聯系。還有研究發現，ALDH2是催化硝酸甘油代謝成有擴血管作用的一氧化氮(NO)的關鍵酶，如果患者基因攜帶ALDH2*1/*2或ALDH2*2/*2，則硝酸甘油在體內的生物轉化過程受阻，難以發揮藥物作用，必須調整治療方案。因此，根據ALDH2基因型制定患者的個體化治療方案具有重要意義。

迄今為止，已報道的ALDH2基因多態性位點檢測的方法有多種，包括PCR產物限制性酶切片段長度多態性(RFLP)、熒光定量PCR、DNA直接測序、高分辨率溶解曲線(HRM)和基因芯片技術等，但這些方法步驟多、耗時長、要求高，難以用于臨床常規檢測。重組酶聚合酶擴增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技術是一種核酸等溫擴增技術，主要依賴重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶三種酶。RMA反應可以在37～42℃進行，整個過程在30min內即可達到檢測水平。鎖核酸(LockedNucleic Acid，LNA)探針是選擇性地將探針中的一些堿基修飾成LNA堿基，大大提高了探針與目的序列的親和力，提高了探針的Tm值。LNA探針比傳統的DNA探針有更高的靈敏度、穩定性和特異性，是一種更為可靠的檢測基因分型的方法。

本發明采用鎖核酸修飾的重組酶介導的等溫擴增法(LNA-RMA法)進行ALDH2基因多態性檢測，更加快速、簡便，能夠提高單堿基突變檢測的特異性和靈敏度。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本申請提供了一種基于鎖核酸修飾的RMA法檢測ALDH2基因多態性的試劑盒及檢測方法，本申請是通過下述方案實現的：

一種基于鎖核酸修飾的RMA法檢測ALDH2基因多態性的引物探針組，包括檢測ALDH2*2的引物、野生型探針和突變型探針，其中，

上游引物：5’-ATTACAGGGTCAACTGCTATGATGTGTTTGGA-3’；

下游引物：5’-GTCTTTACCCTCTCTTGTCACTTCTCAGGCTTA-3’；

野生型探針：

突變型探針：

優選的，所述探針的修飾基團有熒光基團和淬滅基團，所述淬滅基團修飾在THF3’端的T堿基上，熒光基團修飾在SNP位點的5’端T堿基上或SNP位點互補堿基的5’端T堿基上。