[發明專利]一種基于熒光RMA法檢測日本血吸蟲核酸的引物探針組、試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202110229035.2
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN112852975A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 陳大為;陳龍;張瑤
• 申請（專利權）人: 濟南國益生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 濟南信在專利代理事務所(特殊普通合伙) 37271
• 代理人: 殷盛江

本申請屬于生物檢測技術領域，具體為一種基于熒光RMA法檢測日本血吸蟲核酸的引物探針組、試劑盒及其檢測方法；包括檢測日本血吸蟲的引物對及對應的探針，所述日本血吸蟲的檢測探針上標記的熒光報告基團是VIC，熒光淬滅基團是BHQ1；該試劑盒中包括含有擴增反應試劑的檢測管、緩沖液、醋酸鎂、標準陽性質粒、無菌雙蒸水；所述擴增反應試劑單管分裝，為干粉形態，包括RMA引物對及檢測探針組、大腸桿菌RecA蛋白、UvsY蛋白、單鏈結合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚環氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

技術領域

本申請屬于生物檢測技術領域，具體為一種基于熒光RMA法檢測日本血吸蟲核酸的引物探針組、試劑盒及其檢測方法。

背景技術

血吸蟲病是一種具有嚴重危害的人獸共患寄生蟲病，廣泛分布于亞洲、非洲、南美洲和中東國家。現主要存在6種寄生于人體的血吸蟲：日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、間插血吸蟲、湄公血吸蟲和馬來血吸蟲。在我國血吸蟲病的病原是日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)，日本血吸蟲病主要在中國長江流域和長江以南十三個省、直轄市、自治區流行。日本血吸蟲屬于扁形動物門、吸蟲綱、復殖目、裂體科、血吸蟲屬、日本裂體吸蟲種，雌雄異體。日本血吸蟲能夠逃避宿主的免疫攻擊，在宿主的血管中存活長達十幾年甚至更長時間，血吸蟲感染能引起人和家畜的消瘦，重度感染可以造成人和家畜極高的發病率和死亡率。血吸蟲病的診斷是血吸蟲病防治的中心環節，對化療目標人群的確定及化療效果評價、有效控制傳染源和降低蟲卵對環境的污染具有重要意義。

目前日本血吸蟲的檢測主要有病原學診斷、免疫學診斷、分子生物學方法。傳統的病原學診斷方法如毛蚴孵化法陽性率極低，漏檢以及誤診較為常見；免疫學診斷如環卵沉淀試驗、間接血凝試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等由于檢測的是血吸蟲感染后宿主體內產生的抗體，抗體檢測窗口期長，不能區分現癥感染和既往感染；分子生物學方法主要是熒光定量PCR和LAMP恒溫擴增法，但PCR方法需要使用復雜的儀器和裝備精良的實驗室，一定程度上限制了其推廣應用，而LAMP方法對引物的要求較高，且特別容易形成氣溶膠污染，造成假陽性影響檢測結果。

重組酶介導擴增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技術，是近年來發展出的一種敏感、特異、簡便、快捷的等溫核酸擴增技術，被認為是可替代PCR的核酸檢測技術，主要依賴重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶三種酶。RMA反應可以在37～42℃進行，整個過程在30min內即可達到檢測水平，可實現日本血吸蟲的快速檢測。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本申請提供了一種基于熒光RMA法檢測日本血吸蟲核酸的引物探針組、試劑盒及其檢測方法，本申請是通過下述方案實現的：

一種基于熒光RMA法檢測日本血吸蟲核酸的引物探針組，包括檢測日本血吸蟲的引物對及對應的探針，其中，

正向引物：5’-GGACCATGAGTGTTACTAACCGGCTGTAGTGGA-3’；

反向引物：5’-AGCTCACATACGCAACTGCCAACGTGACATAAA-3’；

探針：

5’-TGTCGGAGATGGCGGCTTCACGTGCGTGC(VIC-dT)(THF)(BHQ1-dT)GTCCTTCGGGCATTA(C3-spacer)-3’。

優選的，所述日本血吸蟲的檢測探針上標記的熒光報告基團是VIC，熒光淬滅基團是BHQ1。

一種基于熒光RMA法檢測日本血吸蟲核酸的試劑盒，該試劑盒中包括有：含有擴增反應試劑的檢測管、緩沖液、醋酸鎂、標準陽性質粒、無菌雙蒸水。