[發(fā)明專利]一種降低Taqman探針熒光背景的方法

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• 申請日: 2021-03-01
• 公開（公告）號: CN112979737A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雍金貴;劉宗文;劉倩
• 申請（專利權(quán)）人: 通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司
• 主分類號: C07H21/02
• 分類號: C07H21/02;C07H1/00;C12Q1/6806
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34160
• 代理人: 劉生昕

本發(fā)明公開了一種降低Taqman探針熒光背景的方法，采用固相亞磷酰胺三酯法在全自動DNA合成儀上合成Taqman探針時3端淬滅基團(tuán)CPG先加蓋再脫保護(hù)、耦連、加帽、氧化四步循環(huán)反應(yīng)，再將合成板依次用DEA?ACN混合液和ACN進(jìn)行處理后，進(jìn)行氨解，氨解結(jié)束后，進(jìn)行脫洗將合成板中樣品洗脫至全新96孔板中后，通過HPLC純化分離得到探針，該方法在傳統(tǒng)固相亞磷酰胺三酯法的脫保護(hù)、耦連、加帽、氧化四步循環(huán)反應(yīng)中在首次脫保護(hù)前增加加帽步驟以阻止未標(biāo)上淬滅基團(tuán)的CPG參與后續(xù)反應(yīng)，避免帶熒光標(biāo)記副產(chǎn)物存在，從而降低Taqman探針熒光背景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種降低Taqman探針熒光背景的 方法。

背景技術(shù)

Taqman探針作為核酸檢測試劑盒的核心原料，需要高質(zhì)量來實(shí)現(xiàn)檢測的精 準(zhǔn)度，對其低背景熒光、高靈敏度有更高的要求。本發(fā)明中的Taqman探針合成 方法能較好的降低探針熒光背景，提高靈敏度，為高效的RT-PCR核酸檢測提供 保障。

目前化學(xué)產(chǎn)品很難做到100％純正，故Taqman探針3端淬滅基團(tuán)CPG原料中會 存在少量未標(biāo)記上淬滅基團(tuán)的CPG，全自動DNA合成儀合成核酸引物探針時經(jīng)脫 保護(hù)、耦連、加帽、氧化四步循環(huán)反應(yīng)，得到的Taqman探針中會有純化過程中 不易分離的微量熒光標(biāo)記副產(chǎn)物存在，在后續(xù)qPCR檢測中呈現(xiàn)出稍高的背景熒 光。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種降低Taqman探針熒光背景的方法。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題：

采用固相亞磷酰胺三酯法在全自動DNA合成儀上合成Taqman探針時3端淬滅 基團(tuán)CPG先加蓋再脫保護(hù)，以阻止未標(biāo)上淬滅基團(tuán)的CPG參與后續(xù)反應(yīng)，避免帶 熒光標(biāo)記產(chǎn)物存在，從而降低Taqman探針熒光背景。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種降低Taqman探針熒光背景的方法，具體包括如下步驟：

步驟A1：制備Taqman探針，該探針序列為5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT -BHQ13’，將Taqman探針裝填合成柱，將合成柱裝入合成板中，加入乙酸酐和 1-甲基咪唑，封閉未標(biāo)上淬滅基團(tuán)的CPG后，加入三氯乙酸進(jìn)行反應(yīng)，脫去保 護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5′羥基溶液；

步驟A2：將亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，制得核苷亞磷 酸活化中間體，將核苷亞磷酸活化中間體與游離的5′羥基溶液進(jìn)行縮合反應(yīng) 后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，終止反應(yīng)后，加入碘，進(jìn)行氧化反應(yīng)，使得脫 氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上后，加入三氯乙酸對5′羥基上的保護(hù)基 團(tuán)DMT進(jìn)行脫保護(hù)，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上，再接5′ 端熒光基團(tuán)；

步驟A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，靜置10-15min后，在轉(zhuǎn)速為 3500r/min的條件下，進(jìn)行離心2-3次，每次離心2-3min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)90％ 的ACN，在轉(zhuǎn)速為3500r/min的條件下，進(jìn)行離心2-3min，得到處理后的合成 板；

步驟A4：向氨解儀中加入400mL水，將處理后的合成板加入氨解儀，在壓 強(qiáng)為70-90PSI，溫度為90℃的條件下，通入氨基，進(jìn)行氨解1.5-2h，氨解結(jié)束 后放掉氨氣，拿出合成板冷卻至室溫后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)100％的ACN，在轉(zhuǎn)速為 3500r/min的條件下，離心5min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)90％的ACN，在轉(zhuǎn)速為3500r/min 的條件下，離心5min；

步驟A5：向離心后的合成板中加入TEA，靜置10min后置于全新96孔板 垂直上方，在轉(zhuǎn)速為3500r/min的條件下，進(jìn)行離心5min，將樣品洗脫至全新 96孔板中后，進(jìn)行HPLC純化分離，得到探針。