[發明專利]一組肺癌DNA甲基化分子標志物及其在制備用于肺癌早期診斷試劑盒中的應用

在審

• 申請號: 202110213621.8
• 申請日: 2021-02-25
• 公開（公告）號: CN112941180A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 陸燕;孫喜偉;周莉媛;劉鵬淵;陳恩國
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬婦產科醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6809;G16B25/20;G16B20/30;G16B5/00;G16B40/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 劉靜

1.一組肺癌DNA甲基化分子標志物，其特征在于，所述標志物包括如下20個基因至少一個的甲基化：CDO1，SOX17，TCF21，TRIM58，ITGA9，CYYR1，CLEC14A，SLIT2，ZNF677，IRX2，ACVRL1，OSR1，ADCY8，GALNT13，HSPB6，IRX1，ITGA5，PCDH17，TBX5和TCTEX1D1。

2.根據權利要求1所述一組肺癌DNA甲基化分子標志物，其特征在于，所述標志物通過以下方法獲?。?/p>

(1)RRBS和RNA-seq測序文庫構建及測序：首先分別分離出每個病人肺腫瘤組織及其相鄰正常肺組織樣品中的總DNA，用MspI對基因組進行酶切；對產生的DNA片段進行末端修復；在末端修復后的3’末端添加堿基A；將DNA片段粘性末端A上連接甲基化接頭。然后，選擇40-220bp大小的DNA片段；將選擇的片段進行重亞硫酸鹽處理，使DNA片段中非甲基化的胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶，經PCR擴增后轉變為尿嘧啶；將經過轉換的目的片段進行PCR擴增；分離純化擴增產物，即得到RRBS測序文庫。利用標準Illumina測序試劑進行RNA-Seq文庫構建。測序文庫質檢合格之后上機進行雙端測序，得到測序原始數據。

(2)測序數據分析：對步驟(1)得到的測序原始數據進行質檢。將經過質檢的RRBS讀段和RNA-seq讀段分別用bismark和hisat2工具比對到人類參考基因組上，獲得全基因組上的甲基化圖譜和表達水平信息。

(3)檢測差異甲基化區域(DMR)和差異表達基因(DEG)：對步驟(2)得到的甲基化數據進行聚類分析，然后使用metilene，利用二元分割算法，從腫瘤組織和正常組織中篩選鑒別出差異甲基化區域(DMRs)，最后，采用Wilcoxon秩和檢驗方法對候選的DMRs進行統計檢驗。對于轉錄本數據，用DESeq、edgeR等R程序包鑒定腫瘤組織和正常組織之間的差異表達基因(DEG)。

(4)挖掘肺癌候選甲基化驅動基因：首先將DMRs數據根據基因組信息注釋到基因的功能區間，進行注釋分類；然后提取啟動子區域(TSS上游或者下游2kb區域范圍)的DMR和相應轉錄起始位點對應DEG的表達數據進行相關性分析，選擇負相關關系統計顯著的基因作為異常甲基化驅動候選基因。

(5)機器學習篩選肺癌診斷的DNA甲基化基因指紋：從TCGA公共數據庫中下載肺腺癌(LUAD)和肺鱗癌(LUSC)患者的甲基化和表達譜數據，利用這兩個數據集對步驟(4)篩選出的甲基化驅動基因的甲基化和表達之間的關聯性進行獨立驗證，進一步篩選出可靠的甲基化驅動基因。

3.一種權利要求1所述分子標志物在制備用于肺癌早期診斷的試劑盒中的應用。

4.根據權利要求3所述應用，其特征在于，以篩選出的20個基因的DNA甲基化指紋為基礎，利用焦磷酸甲基化測序或者捕獲二代測序分析腫瘤組織樣本、氣管鏡活檢樣本或血液樣本，采用隨機森林(RF)方法構建肺癌診斷的數學模型，使用ROC曲線及曲線下面積(AUC)來評價效果。