[發明專利]特異性識別N-乙酰神經氨酸的ssDNA適配體及其應用

有效

• 申請號: 202110206562.1
• 申請日: 2021-02-24
• 公開（公告）號: CN113151283B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 周楠迪;岳輝;張雨婷;王曉麗
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53;G01N21/64
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明涉及特異性識別N?乙酰神經氨酸的ssDNA適配體及其應用，通過磁珠?SELEX技術篩選得到4條能夠與Neu5Ac高特異結合的ssDNA適配體序列，其中ap1親和力和特異性最高，結構穩定。在ap1序列基礎上根據二級結構以及分子模擬對接結果對該序列進行截短，得到1條序列長度為21nt的適配體ap2，親和力與截短之前相比有所提升。本發明的ssDNA適配體與Neu5Ac結合的特異性和親和力較高，應用于Neu5Ac檢測時靈敏度高。

技術領域

本發明涉及生物化學與分子生物學、分析化學和組合化學領域，尤其涉及特異性識別N-乙酰神經氨酸的ssDNA適配體及其應用。

背景技術

N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)是研究最多、最深入的唾液酸，它是合成其他種類唾液酸的前體。唾液酸作為糖綴合物的重要組成部分，其所攜帶的負電荷能促進細胞之間的相互排斥，起到穩定細胞膜，增加偶聯糖蛋白粘度的作用等。唾液酸同時還是重要的生物信息傳遞分子，如參與識別宿主與病原體之間以及細胞之間的反應、參與巨噬細胞對衰老紅細胞的吞噬作用等。先前已經證明，一方面，糖蛋白中Neu5Ac的異常表達與各種癌癥密切相關；另一方面，癌癥患者血漿中游離唾液酸以及脂質和蛋白質結合的唾液酸的數量高于健康個體。經研究還發現唾液酸是大腦神經節苷脂的重要組成部分，它們在大腦中信息的傳遞和存儲中起著至關重要的作用，而且Neu5Ac在大腦發育以及細胞膜，膜受體和亞細胞器的正常功能中起到十分重要作用。因此，如何準確識別Neu5Ac并進一步對Neu5Ac單體及其修飾的生物大分子進行追蹤檢測，對于疾病的診斷和治療都有很大的幫助。

目前國內外報道Neu5Ac的檢測方法主要有高效液相色譜法、極譜分析法、分光光度法、薄層色譜法、化學發光法、免疫分析法、液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-質譜聯用法、光譜法、伏安法等。儀器分析方法靈敏度高，準確性好，但設備昂貴難以普及，對實驗人員要求較高，對樣品的預處理比較復雜，并且分析費時，難以滿足輕便高效的現場檢測。免疫分析法檢測Neu5Ac的主要方法是酶聯免疫法。酶聯免疫法是利用結合抗體抗原免疫反應與酶催化反應檢測Neu5Ac，通過抗體(抗原)與酶結合形成酶標記復合物，酶標記復合物在相應的底物中催化反應，通過電信號、光信號或肉眼識別達到檢測目的的檢測分析技術。目前市場上已有一些針對Neu5Ac殘留檢測的ELISA試劑盒產品，不過價格昂貴，酶標抗體的種類有限，并且由于Neu5Ac是小分子化合物，本身不具有免疫原性，生產與應用存在較多的限制。這些都在很大程度上限制了免疫分析方法在Neu5Ac檢測中的應用。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了特異性識別N-乙酰神經氨酸的ssDNA適配體，穩定性強，能夠與Neu5Ac高特異結合，且親和力較高。

本發明的一種特異性識別N-乙酰神經氨酸的ssDNA適配體，核苷酸序列為SEQ IDNO.1-5所示序列(ap1-5)之一。

以上ap1和ap3-5序列中，ap1序列親和力最高。根據二級結構以及分子模擬對接的結果，ap1序列與Neu5Ac的結合位點全部集中在隨機序列N35區域，縮短二級結構莖區長度，得到一段長度為21nt的ssDNA適配體，即ap2序列，親和力有所提升。對適配體序列進行截短優化，保留其與靶分子結合的位點，刪除大量冗余序列，能夠大大降低合成成本。

進一步地，ssDNA適配體的3'端或5'端修飾有功能基團或分子。

進一步地，功能基團或分子為熒光基團、同位素、電化學標記物、酶標記物、親和配基或巰基。功能基團或分子用于提高適配體的穩定性、提供檢測信號，或者用于連接適配體與其他物質形成組合物。

本發明還要求保護上述ssDNA適配體在Neu5Ac檢測中的應用。

一種用于檢測Neu5Ac的組合物，包括上述ssDNA適配體中的一種或多種。

一種用于檢測Neu5Ac的試劑盒，包括上述ssDNA適配體中的一種或多種。