[發(fā)明專利]一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液及其活性研究方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110206301.X
• 申請日: 2021-02-24
• 公開（公告）號: CN113100224A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王小龍;李雯雯;石珂;王彥
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省銀豐生物工程技術(shù)有限公司;銀豐生物工程集團(tuán)有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0775
• 代理公司: 南京君陶專利商標(biāo)代理有限公司 32215
• 代理人: 嚴(yán)海晨

1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟A：進(jìn)行hUC-MSCs的分離，在超凈臺內(nèi)將臍帶用無菌生理鹽水沖洗干凈，剪成小于1mm³的組織塊碎后放入離心管中，將組織塊平鋪于10個T75培養(yǎng)瓶底部，加入含無血清培養(yǎng)基，置于37℃、含5%二氧化碳飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中，對hUC-MSCs進(jìn)行分離；

步驟B：hUC-MSCs的體外擴(kuò)增，細(xì)胞鏡下觀察生長且密度達(dá)70-80%時，開始進(jìn)行傳代操作，輕輕拍打培養(yǎng)瓶側(cè)壁，使組織塊完全脫落下來，將含有組織塊的培養(yǎng)上清液棄掉，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL預(yù)熱的0.05%胰酶，待顯微鏡下細(xì)胞變圓后，用舊培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打，吸取細(xì)胞懸液于離心管中，1500rpm/min，4℃離心5min，收集細(xì)胞，并計數(shù)，以5×10³/cm²的接種密度進(jìn)行傳代；

步驟C：收集P3代細(xì)胞進(jìn)行降溫凍存，將收集的細(xì)胞用程序降溫儀進(jìn)行降溫凍存，并根據(jù)冷凍液濃度不同將其分為五組；

步驟D：hUC-MSCs復(fù)蘇后與新鮮細(xì)胞進(jìn)行比較統(tǒng)計，凍存10個月后將細(xì)胞置于37℃恒溫水浴箱中快速復(fù)蘇，融化后迅速移入離心管中，加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，吹吸混勻，離心棄去上清液后用臺盼藍(lán)溶液計數(shù)計算活率；

步驟E：hUC-MSCs的檢測及鑒定，五組hUC-MSCs復(fù)蘇后進(jìn)行培養(yǎng)，并對各組復(fù)蘇后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步驟A中，在初次培養(yǎng)時，6天后培養(yǎng)液全量換液一次，鏡下觀察是否有細(xì)胞從組織塊周圍爬出，以后每3天換液一次，直至可見細(xì)胞爬出且密度達(dá)70-80%,可以考慮進(jìn)行傳代操作。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步驟C和D中，細(xì)胞冷凍保存時，細(xì)胞降溫、復(fù)溫過程中必須經(jīng)過-15℃～-60℃這一溫度區(qū)間，而該溫度區(qū)間對細(xì)胞具有一定的傷害性，選擇程序降溫儀進(jìn)行程序降溫。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步驟C中，根據(jù)凍存液不同分為五組，DMSO:FBS=1：9、DMSO:FBS:DMEM=1：8.5：0.5，DMSO:FBS:DMEM=1：8：1、DMSO:FBS:DMEM=1：7：2，收集P3代細(xì)胞進(jìn)行程序降溫凍存。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步驟E中，用MTT法比較細(xì)胞生長情況，加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，取復(fù)蘇后對數(shù)生長期細(xì)胞，消化成細(xì)胞懸液，以P3代未凍存細(xì)胞懸液為對照組，調(diào)整細(xì)胞密度，按每孔1*10^4接種96孔板，去除培養(yǎng)基，加入20微升MTT溶液，采用酶標(biāo)儀分別測定5組及對照組細(xì)胞的吸光度，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90 及CD105抗原。