[發(fā)明專利]一種快速高效的香茅原生質(zhì)體制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110205896.7
• 申請日: 2021-02-24
• 公開（公告）號: CN112980764B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹建美;儲昭慶;張凱;蔣敏;宋昌梅
• 申請（專利權(quán)）人: 上海辰山植物園
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 上海段和段律師事務(wù)所 31334
• 代理人: 陳少凌;郭國中

本發(fā)明公開了一種快速高效的香茅原生質(zhì)體制備方法，屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域。采用健康生長的香茅組培苗為實(shí)驗(yàn)材料，使用CPW溶液配制酶解液，采用低速震蕩酶解法對香茅葉片進(jìn)行酶解消化，高效的制備原生質(zhì)體。最后利用蔗糖密度梯度離心法純化收集高質(zhì)量的香茅原生質(zhì)體。本發(fā)明簡單方便，易于操作，且分離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量高，細(xì)胞完整，呈球形，富含葉綠體，具有較高活力。本發(fā)明為利用香茅葉片瞬時轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行基因功能鑒定、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作以及香茅細(xì)胞融合、單細(xì)胞測序等方面的研究應(yīng)用提供重要基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域，涉及一種快速高效的香茅原生質(zhì)體制備方法。

背景技術(shù)

香茅(Cymbopogon citratus)，是香茅屬多年生具有芳香氣味的草本植物，原產(chǎn)于熱帶地區(qū)，如印度、斯里蘭卡等，在我國的廣東、海南、云南等地廣泛分布。古書記載香茅草性味甘、辛、性溫,有疏風(fēng)通絡(luò),溫中止痛、醒腦、止瀉的功效。香茅用作茶飲具有一定的保健作用，其藥理作用主要為抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、抗焦慮、降壓、降血糖等。其莖葉提取的精油在食物、防腐、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

原生質(zhì)體指細(xì)胞通過質(zhì)壁分離，能夠和細(xì)胞壁分開的那部分細(xì)胞物質(zhì)，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，換言之原生質(zhì)體就是除去細(xì)胞壁的被細(xì)胞膜包圍的“裸露細(xì)胞”。植物原生質(zhì)體由于失去了細(xì)胞壁的包被，更易接受外源DNA等物質(zhì)，是進(jìn)行基因功能鑒定、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作等方面的研究的理想材料。

另外原生質(zhì)體融合技術(shù)對于培育新品種同樣有著重要意義。目前對香茅的研究主要集中在有效化學(xué)成分的提取、分離及活性研究上。未發(fā)現(xiàn)關(guān)于香茅原生質(zhì)體制備的研究報(bào)道，因此，現(xiàn)在急需一種快速高效的香茅原生質(zhì)體的制備方法，為后續(xù)利用原生質(zhì)體進(jìn)行基因功能鑒定、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作以及細(xì)胞融合、單細(xì)胞測序等方面的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種簡單、快速高效的香茅原生質(zhì)體制備方法。利用本發(fā)明的方法可獲得大量活性高的原生質(zhì)體，進(jìn)而為后續(xù)利用原生質(zhì)體進(jìn)行基因功能鑒定、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作以及細(xì)胞融合、單細(xì)胞測序等方面的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種香茅原生質(zhì)體的制備方法，利用香茅組培幼苗為材料，利用CPW溶液配制酶解液，采用低速震蕩酶解法對香茅葉片進(jìn)行酶解消化，制備原生質(zhì)體；通過蔗糖密度梯度離心法來純化收集香茅原生質(zhì)體。

作為一個實(shí)施方案，以組織培養(yǎng)的香茅幼嫩葉片為材料，利用纖維素酶和離析酶酶解去除細(xì)胞壁，通過蔗糖密度梯度離心獲得健康完整的香茅葉肉原生質(zhì)體。

作為一個實(shí)施方案，所述制備方法包括以下步驟：

S1、香茅組培苗培養(yǎng)：剪取香茅的健壯的幼莖，消毒后移至1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)；

S2、原生質(zhì)體酶解：選取步驟S1中生長狀態(tài)良好的組培幼苗，棄葉片下部及頂部，切成條狀，放入酶解液中(使酶解液充分浸沒葉片)；(然后置于水平搖床上)25℃-30℃避光條件下，50-60rpm低速震蕩酶解3-4h，最后70-80rpm振蕩5-10分鐘；

S3、原生質(zhì)體分離：吸取步驟S2所得酶解混合液，過濾，濾液離心；

S4、蔗糖密度梯度離心法純化：將步驟S3所得離心產(chǎn)物棄上清，用W5溶液重懸原生質(zhì)體沉淀，然后在濾液下層注入含10％-20％的蔗糖的CPW溶液，避免震蕩混溶，離心，在兩液相之間出現(xiàn)一條綠色帶，即純凈的原生質(zhì)體；

S5、原生質(zhì)體收集：(用移液器)吸取中間層的原生質(zhì)體，加入W5溶液，離心，棄上清，加入MMG溶液懸浮沉淀。

作為一個實(shí)施方案，步驟S1中，培養(yǎng)時間約2-3周。