[發明專利]一種高病毒產量乙型肝炎病毒表達載體的構建及應用

在審

• 申請號: 202110205319.8
• 申請日: 2021-02-24
• 公開（公告）號: CN112813102A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 張全;劉婷婷
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫院
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/66;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 上官鳳棲

本發明涉及一種高病毒產量乙型肝炎病毒表達載體，該載體使用外源CMV啟動子來啟動乙型肝炎病毒pgRNA的轉錄，使用外源牛生長激素多腺苷酸化信號終止轉錄。本發明還涉及該載體的構建方法以及應用。本發明改造后的HBV表達載體，同初始HBV表達載體相比，其病毒表達水平得到了很大提升，產生的病毒顆粒量提高了約25倍，可以有效的體外感染細胞，從而可以用來研究不同HBV病毒株生活史早期感染階段特征，以及開發和評價靶向HBV生活史早期感染階段的藥物。

技術領域

本發明屬于病毒分子生物學領域，涉及一種高病毒產量乙型肝炎病毒表達載體的構建及應用。

背景技術

HBV基因組為松弛環狀的雙鏈DNA（rcDNA），長度約3.2 kb。目前已知HBV基因組序列有較高的多樣性。根據HBV全基因組核苷酸序列異源性≥8%，可將HBV分為10個基因型（A-J）。這些基因型又可進一步細分為許多具有特定地理分布的亞基因型。除此之外，臨床上還發現了大量各種變異的病毒株，包括免疫逃逸株、耐藥突變株等。臨床相關性研究表明不同序列的HBV病毒株在疾病進展、自然史和對治療的應答方面均有所不同，因此研究不同HBV病毒株的病毒特征差異對于預防、診斷或治療HBV非常必要。

研究不同HBV病毒株的病毒特征，主要是通過分子克隆的方法將病毒基因組構建到表達載體中，然后在體外細胞模型上進行深入研究。通過簡單的瞬時轉染的方法可將HBV表達載體運送到肝癌細胞系的細胞核中，然后HBV表達載體可以模擬HBV cccDNA的功能，轉錄出所有類型的病毒RNA。病毒RNA被轉錄后，后續的翻譯、包裝、病毒DNA合成和病毒顆粒釋放同真正的病毒復制過程基本一致。因此該瞬時轉染方法可以模擬HBV生活周期的后期復制階段，被廣泛用來研究病毒生活周期的后期復制階段特征，以及不同病毒株對臨床應用的病毒聚合酶抑制劑敏感性的影響，對我們了解和治療HBV發揮了巨大作用。但是該方法不能模擬HBV生活史早期感染階段（從結合肝細胞表面受體開始，到進入細胞，再被運送到細胞核形成cccDNA），因此不能用來篩選靶向HBV早期感染階段的藥物和評價不同病毒株對治療方法的敏感性，例如用該模型無法測定不同病毒株對HBV免疫球蛋白的應答。

為了研究不同HBV病毒株生活史早期感染階段的特征和評價它們對靶向該階段的藥物敏感性，需要制備不同基因序列的病毒顆粒來進行體外感染細胞實驗。目前能用來進行體外細胞感染實驗的病毒顆粒幾乎全部來源于兩個穩定表達HBV的細胞系HepG2.2.15和HepAD38，但是這兩個細胞系只能提供單一的D型HBV病毒顆粒（在我國主要流行的是B型和C型）。只有瞬時轉染的方法才可以很方便的產生各種不同基因組序列的病毒顆粒，只需將含不同HBV病毒株基因組的表達載體轉染到肝癌細胞系中即可，但是該方法產生的病毒顆粒滴度較低，無法有效的感染細胞。該難題嚴重影響了我們對HBV生活史早期感染階段的研究，以及開發和評價靶向HBV早期感染階段的藥物。

要解決體外細胞感染實驗中HBV病毒顆粒來源難題，就需要優化現有的HBV表達載體，提高病毒表達水平，從而增加釋放的病毒顆粒滴度。目前最常用的HBV表達載體是包含1.3倍HBV基因組的質粒，該載體使用HBV自身的增強子和啟動子來啟動病毒各個基因的轉錄，同時使用自身的多聚腺苷酸信號位點來終止轉錄。使用含1.3倍HBV基因組的質粒來表達HBV病毒，其病毒產量很難滿足體外感染實驗的需要。因此，需要對載體做進一步的改進。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種高病毒產量乙型肝炎病毒表達載體，克服現有的乙型肝炎病毒表達載體病毒產量低，不能滿足體外細胞感染實驗需要的問題。

本發明的第二目的是提供上述高病毒產量乙型肝炎病毒表達載體的構建方法。

本發明的第三目的是提供上述高病毒產量乙型肝炎病毒表達載體的應用。

本發明通過以下技術方案來實現：

一、一種高病毒產量乙型肝炎病毒表達載體，該載體使用外源CMV啟動子來啟動乙型肝炎病毒pgRNA的轉錄，使用外源牛生長激素多腺苷酸化信號終止轉錄。