[發明專利]一株重樓內生真菌在制備抗腫瘤藥物中的應用

在審

• 申請號: 202110204563.2
• 申請日: 2021-02-24
• 公開（公告）號: CN112852643A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 劉紅美;張功友;王兵
• 申請（專利權）人: 貴州醫科大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12Q1/02;A61K36/062;A61P35/00;C12R1/645
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一株重樓內生真菌在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，包括如下步驟：菌株的分離純化、菌株鑒定、Rhizopycnis vagum菌株發酵液粗提物活性成分的提取、發酵液粗提物活性成分的體外抗腫瘤實驗，所述菌落特征為在馬鈴薯平板培養基(PDA培養基)上28℃生長15d后，菌落直徑為90mm，菌落呈灰白色，環狀；菌絲體稠密，表面呈絨毛狀；菌落背面中心呈灰色，有徑向裂紋，外部呈深棕色，并帶有淺紅色斑塊，在培養過程中未形成分生孢子；分生孢子細胞為腸母細胞，菌落狀，有多個分枝，透明光滑；菌絲體中形成不規則的黑色厚壁孢子，顏色為棕色或黑色，厚壁，常具球狀突起，短鏈至長鏈。

2.根據權利要求1所述的一株重樓內生真菌在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述菌株的分離純化方法如下：將采集的新鮮重樓塊莖用75％乙醇和0.1％升汞消毒后接種于馬鈴薯瓊脂平板上(添加了質量濃度為100μg/L的青霉素G鈉和硫酸鏈霉素)，置于28℃霉菌培養箱中培養7天，挑取重樓塊莖上生長出的菌絲接種于新的馬鈴薯瓊脂平板上，再生長7天后，挑取菌落外圍的菌絲接種于新的馬鈴薯瓊脂平板上，反復轉接3-5次，以獲得純種的菌種。

3.根據權利要求1所述的一株重樓內生真菌在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述菌株鑒定方法為：提取分離菌株的基因組DNA，并擴增其ITS及LSU序列，將擴增產物送測序部門，將獲得的基因序列在NCBI上進行序列相似性比對分析，再使用MEGA7.0構建鄰接(Neighbor-Joining)法系統發育進化樹；結合菌株形態鑒定，并將將該菌株鑒定為Rhizopycnis vagum，并命名為AS6-ASP。

4.根據權利要求1所述的一株重樓內生真菌在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述Rhizopycnis vagum菌株發酵液粗提物活性成分的提取：將純化好的菌株接種于液體發酵培養基(麥芽糖4g/L，天冬酰胺40g/L，KH₂PO₄ 1.52g/L，KCl 0.52g/L，MgSO₄·7H₂O0.52g/L，FeSO₄·7H₂O 0.001g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.001g/L，CuSO₄·5H₂O 0.001g/L，pH 6.0)中，置于全溫振蕩培養箱中28℃、200r/min培養6天，將發酵液6000r/min 4℃離心15min，收集上清，并用0.45μm和0.22μm的濾膜過濾；將過濾液用70％的硫酸銨進行沉淀，冰浴條件下攪拌1h，4℃條件下靜置過夜；進一步將沉淀后的溶液12000r/min 4℃離心30min，收集沉淀，并溶解于少量的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)中；再用截留分子量為10kDa的超濾離心管4000r/min 4℃離心15min；將過濾后的溶液進行冷凍干燥成粉末，并凍于-80℃備用。

5.根據權利要求1所述的一株重樓內生真菌在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述發酵液粗提物活性成分的體外抗腫瘤實驗方法如下：取對數生長期的CT26(結直腸癌細胞)、HepG2(肝癌細胞)、HeLa(宮頸癌細胞)、和L02細胞(人正常肝細胞)接種于96孔板(每孔接種5×10³個細胞，100μL/孔)，37℃，5％CO₂培養箱中孵育24小時；用不含血清的DMEM培養基對接種細胞進行饑餓處理24小時，使所有細胞同步于細胞周期的G0/G1期；將冷凍干燥后的樣品用含2％血清的DMEM培養基的配成5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL、0.078125mg/mL 7個藥物濃度進行給藥處理48h，用相同濃度的Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)作為對照，每個濃度設置5個副孔，陰性對照組為有細胞但不給藥的無血清培養基，空白對照組為無細胞不給藥的無血清培養基，培養結束后，小心吸棄上清，將無血清DMEM培養基與CCK-8溶液按9：1的比例配置成溶液，并向每孔里面加入100μL，繼續培養2小時，酶標儀450nm條件下測定OD值，根據公式：細胞存活率＝[(A實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100％即可求得細胞存活率，細胞存活率越低，藥物抑制作用越大。