[發明專利]內消旋-二氨基庚二酸脫氫酶突變體及其應用

在審

• 申請號: 202110203953.8
• 申請日: 2021-02-23
• 公開（公告）號: CN112746061A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 吳靜;盧翠;劉佳;宋偉;陳修來;高聰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了內消旋?二氨基庚二酸脫氫酶突變體及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明的改造方法通過組合突變設計出最佳突變體，對PvDAPDH的蛋白質進行改造，克服了之前野生型的酶因為活性低而導致的轉化率低的局限，最終得到最佳突變體L7(PvDAPDH^{W121A/H227I/R180S})，其酶活為野生型的85倍；將該突變體L7進一步與L?氨基酸脫氨酶(PmLAAD)和葡萄糖脫氫酶(BmGDH)級聯，以L?苯丙氨酸為底物，D?苯丙氨酸產量達到48.5g/L，因此大大降低了之前的高菌體量以及昂貴的底物成本，為D?苯丙氨酸的工業化生產奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及內消旋-二氨基庚二酸脫氫酶突變體及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

D-苯丙氨酸，又名(R)-2-氨基-3-苯基丙酸，是一種非天然的氨基酸。D-苯丙氨酸的理化性質與L-苯丙氨酸類似，但具有特殊的手性結構和生物活性，既可作為原料，又是治療2型糖尿病藥物-如那格列奈等的重要前體物質，因此在工業、農業、食品、醫藥等領域有著L-苯丙氨酸不可比擬的應用價值。

目前，D-苯丙氨酸的主要生產方法為生物法，包括海因酶法、轉氨酶法和不對稱拆分法，但是這些方法耗時長、過程復雜、產率低，無法滿足工業應用。通過酮酸的一步還原胺化制備D-苯丙氨酸具有生產過程簡單、工藝條件溫和、耗時短產率高等特點，可以減輕環境和資源壓力，因此迫切需要一種高效制備D-苯丙氨酸的生物法。

酮酸一步還原胺化法生產D-苯丙氨酸涉及到一個關鍵的酶內消旋-二氨基庚二酸脫氫酶(meso-DAPDH，meso-Diaminopimelate Dehydrogenase，EC 1.4.1.16)，它具有較為寬泛的底物譜，能夠催化苯丙酮酸，使其在α-羰基還原胺化，形成D-苯丙氨酸。然而，meso-DAPDH對非天然底物活性較低，且以輔因子NADPH為氫供體，常常限制其在工業上的應用。因此，近年來，對meso-DAPDH的研究主要集中在蛋白質工程改造以提高活性，擴大底物譜，改變輔因子偏好性等等。通過對結合口袋的半理性改造，以及結合非理性的易錯PCR等手段，創造出了一些性能提升的突變體。但是目前改造的酶活力仍然較低，無法適應工業化生產的需求。

發明內容

鑒于目前發現的野生型L-氨基酸脫氨酶酶活較低或改造效果不理想，本發明提供了一種可以高效制備D-苯丙氨酸的PvDAPDH突變體及其改造方法，利用該突變體與L-氨基酸脫氨酶(PmLAAD)、葡萄糖脫氫酶(BmGDH)級聯，以廉價底物L-苯丙氨酸制備D-苯丙氨酸。本發明所構建的菌株在D-苯丙氨酸制備中具有反應簡單，投菌量低，低耗時短，極大節約了工業化的生產成本。

本發明提供了內消旋二氨基庚二酸脫氫酶PvDAPDH突變體，所述突變體將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的內消旋二氨基庚二酸脫氫酶PvDAPDH的第121位、第180位、第181位、第227位的氨基酸中的一個或多個進行突變。

在一種實施方式中，編碼所述內消旋二氨基庚二酸脫氫酶PvDAPDH基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一種實施方式中，所述突變體相對于PvDAPDH親本，將其第121位的色氨酸突變為丙氨酸，獲得突變體W121A。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體相對于PvDAPDH親本，將其第227位的組氨酸突變為異亮氨酸，獲得突變體H227I。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體相對于PvDAPDH親本，將其第180位的精氨酸突變為絲氨酸，獲得突變體R180S。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體相對于PvDAPDH親本，將其第181位的精氨酸突變為絲氨酸，獲得突變體R181S。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體相對于PvDAPDH親本，將其第121位的色氨酸突變為丙氨酸，并同時將第227位的組氨酸突變為異亮氨酸，獲得突變體W121A/H227I。