[發明專利]一種雞RPS14多克隆抗體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110202465.5
• 申請日: 2021-02-23
• 公開（公告）號: CN112759645A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 劉平;胡國良;郭小權;顧玥明;施燕;劉佩;曹華斌;程素芳;李麟;李谷月;黃橙;趙玉蘭;郭鳳萍;李慶慶;方瑋樂
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06;C12N15/70;C12N15/12;G01N33/68
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 王穎

1.一種雞RPS14基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)以雞的cDNA為模板，進行RPS14基因的PCR擴增得到目的片段，所述PCR擴增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；(2)利用所述目的片段與PET-28a(+)表達載體連接構建得到重組表達質粒PET28a-RPS14；(3)將所述重組表達質粒PET28a-RPS14轉入Rosetta(DE3)感受態細胞后進行原核表達，純化后透析復性獲得雞RPS14重組蛋白；(4)利用所述雞RPS14重組蛋白免疫兔子后采血，分離血清得到所述雞RPS14基因多克隆抗體；(5)利用酶聯免疫吸附試驗、蛋白免疫印記檢測或免疫熒光技術對所述雞RPS14基因多克隆抗體進行抗體質量驗證。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)PCR擴增的程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，56℃退火35s，72℃延伸40s，共35個循環；72℃延伸10min。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)原核表達的具體步驟為：在轉入PET28a-RPS14的Rosetta(DE3)感受態細胞中加入終濃度為1mM的IPTG，于37℃，220rpm/min的搖床上搖4h。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)純化的洗脫液為500mM咪唑濃度的洗脫液。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)透析復性具體為利用尿素梯度下降透析目的蛋白，同時透析液置于4℃環境中每4h更換一次。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)雞RPS14重組蛋白免疫兔子的具體方法為：雞RPS14重組蛋白多點皮下注射于新西蘭大白兔中引起免疫反應，每10天加強免疫一次，總共免疫30天。

7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述酶聯免疫吸附試驗中其抗原包被的最佳稀釋濃度為2.5μg/ml；抗RPS14血清和免疫前血清的稀釋梯度都是1:100-1:204800；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG稀釋濃度為1：3000；酶標儀的反應波長為450nm；

所述蛋白免疫印記檢測中抗RPS14血清和免疫前血清的稀釋比例為1：3000；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG的稀釋比例為1：1000；

所述免疫熒光技術中抗RPS14血清和免疫前血清的稀釋比例為1：200；CY3標記山羊抗兔IgG(H+L)的稀釋比例為1：300。

8.一種根據權利要求1-7任一項所述的制備方法制備的雞RPS14多克隆抗體。

9.一種根據權利要求8所述的雞RPS14多克隆抗體在制備雞肺動脈高壓和/或腹水類疾病檢測工具中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述工具為試劑或試劑盒。