[發明專利]以修飾的MSC培養記憶型T細胞的方法

在審

• 申請號: 202110201797.1
• 申請日: 2021-02-23
• 公開（公告）號: CN112941032A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 段海峰;薛冰華;于婷婷;解晶;張超;龐如夢;劉麗華;陸穎
• 申請（專利權）人: 北京雙因生物科技有限公司;北京匯智馳康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0775;C12N5/0783
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

一種以修飾的MSC培養記憶型T細胞的方法，其中修飾的MSC表達IL?15和IL?7；為了提高活性對IL15進行了突變；此外還提供了使用前述MSC制備的細胞培養瓶。

技術領域

本申請屬于細胞培養技術領域，具體地，本申請提供了以修飾的MSC培養記憶型T細胞細胞的方法，其中修飾的MSC表達IL-15和IL-7。

背景技術

記憶型T細胞(Tcm)是幼稚T細胞經過抗原激活后，產生的具有長期記憶性的，并能夠歸巢到淋巴結接受抗原再刺激的T細胞，在抗原的再次刺激之下，可繼續產生大量的攜帶同種抗原的克隆化的效應記憶型T細胞(Tem)細胞。記憶型T細胞的生物標記為CD62L和CD45ROa雙陽性的細胞，這代表了記憶型T細胞能夠通過淋巴屏蔽，回歸淋巴結，同時處于被抗原激活的狀態。

記憶型T細胞細胞抗腫瘤具有以下特點：第一，由于其表達CD62L+，在淋巴結更易接受APC遞呈的抗原信息而二次活化；第二，記憶型T細胞回輸到體內可被腫瘤抗原在激活起到直接殺傷腫瘤的作用；第三，記憶型T細胞細胞具有自我更新及復制能力，在體內存活時間長，可起到長期抗腫瘤作用；第四，在體外能夠高效率擴增保證T細胞的回輸數量。

目前已知的記憶型T細胞制備方法是從外周血中分離原代初始型T細胞，先利用CD3單克隆抗體和IL-2進行活化。活化24小時后，加入包括IL-7、IL-15和IL-21的培養基進行培養。培養至6-9天后收獲細胞。由于記憶型T細胞細胞亞群的增殖特點，在體外培養中，隨著培養時間的延長，記憶型T細胞細胞亞群的比例會迅速降低。因此，短期培養工藝無法保證獲得足夠數量的目的細胞，而增加初始種子細胞的培養數量，又會使制備成本急劇增加。因此，如何利用經濟高效的方法獲得記憶型T細胞是目前需要解決的一個技術難題。

發明內容

針對以上問題，申請人發展了一種以修飾的MSC培養記憶型T細胞的方法，其中修飾的MSC表達IL-15和IL-7；為了提高活性對IL15進行了突變；此外還提供了使用前述MSC制備的細胞培養瓶。

一方面，本申請提供了一種修飾的MSC細胞，其特征在于，所述MSC細胞表達IL-15和IL-7。

進一步地，所述IL-15和IL-7的蛋白序列分別為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.5或其變體。

進一步地，所述MSC中IL-15和IL-7的融合基因序列為SEQ ID NO.7。

進一步地，所述MSC為脂肪MSC或臍帶MSC。

另一方面，本申請提供了一種細胞培養瓶，其包含前述MSC細胞。

進一步地，所述培養瓶中的MSC細胞被固定形成飼養層。

進一步地，使用無水乙醇進行所述固定。

另一方面，本申請提供了使用上述MSC或培養瓶培養記憶型T細胞的方法。

另一方面，本申請提供了制備前述MSC細胞的方法，包括：構建IL-15和IL-7載體；制備慢病毒顆粒；感染MSC細胞。

本申請中MSC細胞的構建過程中使用的分子生物學技術為本領域技術人員熟知的常規技術，本領域技術人員可以從諸如《分子克隆》，薩姆布魯克，科學出版社等著作中獲得，也可以查閱相關文獻或使用現有的引物設計、蛋白功能預測等工具軟件。

本申請中的IL-15和IL-7序列不限于本申請中列出的種類，本領域技術人員可以從Genbank等網站獲得各種不如動物白介素序列并常識將其用于本申請的方法，也可以以蛋白領域的現有知識和功能預測方法/軟件從上述序列獲得變體序列。所述變體序列與親本序列享有一定的序列同一性，如70％以上，80％以上，90％以上，95％以上，99％以上，并且具備與親本序列基本相同的功能。