[發(fā)明專利]一種新型組成型啟動子、重組地衣芽孢桿菌及其應用

有效

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• 申請日: 2021-02-23
• 公開（公告）號: CN112795569B
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 石貴陽;李由然;趙鑫馨;張梁;丁重陽;徐沙;顧正華
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N1/21;C12N15/56;C12N15/75;C12N9/24;C12R1/10
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶啟新

發(fā)明公開了一種新型組成型啟動子、重組地衣芽孢桿菌及其應用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過PCR獲得Bacillus licheniformis來源的強組成型啟動子P2以及Thermobifida fusca NTU22來源的麥芽三糖淀粉酶目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHY?P2?tfa，并轉(zhuǎn)化至地衣芽抱桿菌Bacillus licheniformis，得到重組地衣芽抱桿菌。本發(fā)明以食品安全的地衣芽孢桿菌為表達宿主，利用新型高活性啟動子P2實現(xiàn)麥芽三糖淀粉酶的重組表達。混合碳源麥芽糊精60g/L，葡萄糖10g/L以及42℃的發(fā)酵條件更有利于產(chǎn)酶，重組菌發(fā)酵的最高酶活達到578.47U/mL。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種新型組成型啟動子、重組地衣芽孢桿菌及其應用。

背景技術(shù)

啟動子是合成生物學的基本表達元件之一，在調(diào)控合成代謝中起著重要作用。在基因的表達過程中，RNA聚合酶能特異性識別并結(jié)合啟動子的特定序列，從而控制基因轉(zhuǎn)錄表達的起始時間和表達強度。在工業(yè)微生物表達合成高附加值化合物時，啟動子對合成途徑的調(diào)控作用往往決定著生產(chǎn)效率。

啟動子在真核和原核表達系統(tǒng)中的研究和應用已經(jīng)比較成熟。在酵母中，組成型的PTEF、PHXT7和PGPD等啟動子已應用于代謝工程在原核微生物中，大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的最早，最成熟的是采用啟動子T7、lac,tac的表達系統(tǒng)。隨著分子生物學的發(fā)展，革蘭氏陽性細菌芽孢桿菌逐漸被開發(fā)成為一類重要的原核表達系統(tǒng)。在枯草芽孢桿菌中應用最為廣泛的是P43、Pxyl等啟動子。

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)作為一種有效的外源基因表達系統(tǒng)，具有發(fā)酵周期短，熱穩(wěn)定性好，蛋白分泌能力強等優(yōu)勢，被認定為生物安全GRAS(Generallyregarded as safe)菌株。地衣芽孢桿菌在酶表達、代謝產(chǎn)物合成方面有著很好的應用前景，用于生產(chǎn)蛋白酶，淀粉酶，果膠酶等工業(yè)酶以及抗生素、檸檬酸、谷氨酸等物質(zhì)。

麥芽三糖淀粉酶(maltotriose-producingα-amylase)屬于糖苷水解酶GH13家族。可作用于淀粉及相關(guān)多聚糖，生成的主要產(chǎn)物為麥芽三糖。麥芽三糖能抑制人體腸道里有害菌的生長和淀粉的老化，是一種具有營養(yǎng)保健功能的糖源。

發(fā)明內(nèi)容

針對目前重要工業(yè)微生物地衣芽孢桿菌十分缺乏合成生物學標準化元件，現(xiàn)有啟動子主要來源于枯草芽孢桿菌等模式微生物，表達異源基因效果不甚理想以及缺乏生產(chǎn)麥芽三糖淀粉酶的高效方法，本發(fā)明提供了一種來源于地衣芽孢桿菌的新型組成型P2啟動子和麥芽三糖淀粉酶基因的重組質(zhì)粒，可實現(xiàn)麥芽三糖淀粉酶在地衣芽孢桿菌食品安全型微生物宿主中的高效制備。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種新型組成型啟動子P2，所述組成型啟動子P2來源于保藏編號為Bacilluslicheniformis ATCC14580，Bacillus licheniformis ATCC12759，Bacilluslicheniformis ATCC9945，Bacillus licheniformis ATCC13438或Bacilluslicheniformis ATCC9259的地衣芽孢桿菌中。

進一步的，所述新型組成型啟動子P2的核苷酸序列見SEQ ID NO:1。

進一步的，一種重組地衣芽孢桿菌，所述重組地衣芽孢桿菌啟動子為新型組成型啟動子P2，且所述重組地衣芽孢桿菌含有麥芽三糖淀粉酶基因片段。

進一步的，所述重組地衣芽孢桿菌的重組表達載體為pHY-P2-tfa。

進一步的，所述pHY-P2-tfa是通過將權(quán)利要求1中所述新型組成型啟動子P2克隆到pHY300-PLK質(zhì)粒，并將權(quán)利要求3中所述麥芽三糖淀粉酶基因片段克隆到上述所得質(zhì)粒中得到。

進一步的，一種重組地衣芽孢桿菌的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法為：